Journal of Functional Foods：新型超熱穩定性支鏈澱粉酶簡化大米澱粉製備抗性澱粉的工藝

近期，安徽大學生命科學學院彭惠教授團隊在國際期刊《Journal of Functional Foods》（農林科學2區）線上發表了題為“Using a novel hyperthermophilic amylopullulanase tosimplify resistant starch preparation from rice starches”的研究論文。彭惠教授為通訊作者和第一作者。

抗性澱粉（RS）被認為是一種膳食纖維，近年來因其對腸道健康的重要作用而備受關注。抗性澱粉有五種型別：物理不可及澱粉（RS1）、天然顆粒狀澱粉（RS2）、回生澱粉（RS3）、化學改性澱粉（RS4）和直鏈澱粉-脂質複合物（RS5）。其中，RS3在大部分食品加工過程中的穩定性高，可用作多種功能性食品的配料，因而引起了研究者們的廣泛興趣。RS3主要由糊化後的直鏈澱粉回生重排而成，一般可以透過加熱等物理方法、酶解法去分枝處理或者兩種方法的結合來製備。由於直鏈澱粉含量在熱處理過程中沒有顯著增加，因而熱處理法制備RS3的含量只有20-30%。

相比之下，酶解法去分枝處理製備RS3的含量較高。普魯蘭酶是一種典型的脫枝酶，可以水解支鏈澱粉中的1，6-糖苷鍵，增加直鏈澱粉含量，從而產生更多的RS3。在一些特定條件下，將普魯蘭酶與水解1，4-糖苷鍵的α-澱粉酶聯合使用，可以產生較短的直鏈澱粉，進一步促進RS3的產生。然而，α-澱粉酶對澱粉的水解程度需要嚴格控制，以避免產生過多短的直鏈澱粉。聚合度低於10的直鏈澱粉會抑制結晶，從而減少RS3的生成。此外，α-澱粉酶與普魯蘭酶有著不同的最適溫度和pH值，在α-澱粉酶處理結束後需要調整反應條件，增加了生產成本。

支鏈澱粉酶（EC 3。2。1。1/41）是一種雙功能的Ⅱ型普魯蘭酶，能夠水解澱粉和寡糖中的1，4-糖苷鍵和1，6-糖苷鍵。一些古細菌如

Thermococcuskodakarensis

、

Thermococcuskodakarensis

、

Caldivirgamaquilingensis

和

Sulfolobus acidocaldarius

產的支鏈澱粉酶在極高的溫度下（90-105℃）依然可以保持穩定。由於澱粉在酶解前需要高溫（70-100℃）糊化，因此在生產RS3的過程中，超熱穩定性支鏈澱粉酶可以一步完成澱粉糊化和雙重酶解。

超嗜熱菌（

Aquifex aeolicus

）是已知的最耐熱細菌，能夠在95℃下生長。該研究團隊克隆了超嗜熱菌VF5中編碼糖苷水解酶家族57（GH57）蛋白的基因，然後在大腸桿菌（

Escherichia coli

）中過表達，所得蛋白被命名為“APU_Aquae”。研究結果顯示，APU_Aquae是一種雙功能支鏈澱粉酶，對大米澱粉具有極高的水解活力，在100℃下的半衰期為7 h，表現出極好的熱穩定性。採用APU_Aquae一步完成了由大米澱粉製備RS3的澱粉糊化和酶法水解，整個工序耗時僅7h，遠短於其他酶法處理工序。大米澱粉經APU_Aquae處理後，RS3含量為40。5±0。7%。APU_Aquae處理產生了更多聚合度在13-24的中度分枝澱粉，這可能是促進RS3形成的主要原因。因此，本研究為工業化高效製備RS3提供了一種新的方案。

Table 1

Hydrolysis of various substrates by therecombinant APU_Aquae-p from

A。 aeolicus

Table2

Preparation ofresistant starch by a combined enzymatic and physical method

Fig. 1.

Sodiumdodecyl sulfate–polyacrylamidegel electrophoresis （SDS-PAGE）of purified recombinant proteins： lane M， marker（kDa）； lane 1， cell extract ofE。 coli harboring pET28a； lane 2， cell extract of E。 coli harboring pET28aAPU_Aquae； lane 3， cell extract of E。 coli harboring pET28a-APU_Aquae-p；lane 4， partiallypurified APU_Aquae solution after heat treatment （85℃，15min）； lane 5， partially purified APU_Aquae-p solution after heat treatment（85℃， 15 min）； lane 6， the purifiedAPU_Aquae protein； lane 7， the purifiedAPU_Aquae-p protein。 The partiallypurified enzymes were the supernatantsthat were not concentrated aftercentrifugation。 The purified enzymes were theeluents of Ni-NTA agarose gelcolumn without concentration treatment。

Fig. 2.

Thin-layer chromatography （TLC） analysis ofproduct formation duringdegradation of pullulan。 Pullulan （0。1%） was digestedwith 5 U of APU_Aquae-pat 108℃ in 50 mM MES-BisTrisPropane buffer （pH 6。0） forvarious times。 LaneStd， standard maltooligosaccharides were indicated by G1-G5。

Fig. 3.

Effects of temperature and pH onamylopullulanaseactivity and stability ofAPU_Aquae （white） and APU_Aquae-p（black）。 （a） Effectof temperature onenzyme activity。 （b） Effect of pH on enzymeactivity。 （c）Effect of temperature on enzymestability。 The enzyme solutions were incubatedin 50 mM MES-BisTrisPropane buffer（pH 6。0， without substrate） at 95℃ （■， □），100◦C（●， ○） and 105℃ （▴，△） for differenttime periods， and the residualactivity wasmeasured。 Values are the means ± SD of sixexperiments （n = 6）。

Fig. 4.

High-performance anion exchange chromatography（HPAEC） of hydrolytic products from 10% rice starch incubated with APU_Aquae-p（150 U/gstarch） at 100℃ and pH 6。0 for 7 h

Fig. 5.

Scanning electron micrographs of native （unprocessed） ricestarch （a）； resistant starch III （RS3） treated by the dual autoclaving/coolingalone， RS3 contentwas 28。4 ± 0。6% （b）； RS3 treated by APU_Aquae-p， followingthe dual autoclaving/cooling， RS3 content was 40。5 ± 0。7% （c）。

文獻來源：

https：//

doi。org/10。1016/j。jff。2

021。104429