劉斌教授《ACS Nano》：小小奈米球！即可破除腫瘤缺氧和內在抗氧化，助力光動力學療法​

光動力學療法（PDT）

是光敏劑（PS）與相應波長的光作用發生光動力反應，產生活性氧（ROS），從而殺死腫瘤細胞的治療方法。其具有創傷小、毒副作用小、選擇性好、可重複性好等優點。然而，由於傳統PS固有的聚集猝滅效應（ACQ）、體內腫瘤缺氧微環境和內在的抗氧化性等因素的影響，導致目前的臨床PDT實際效率比較低下。目前，大多數廣泛使用的PSs（如卟啉衍生物）都會在水中發生聚集，出現熒光猝滅和減少生成ROS現象都會對降低PDT的實際療效。因此，非常有必要開發出具有聚集態的高熒光和高光毒性的新型PSs。此外，腫瘤微環境（TME）中缺氧不利於ROS的生成，也會降低PDT效率。雖然透過MnO2、奈米級金屬有機骨架（MOFs）等可以提高O2濃度，以增強PDT的作用，但是僅增加O2濃度還不夠，因為被啟用的癌細胞記憶體在的抗氧化物質（如GSH）會消耗掉氧氣。在PDT治療後，癌細胞過表達B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）來響應PDT，Bcl-2產生更高的GSH細胞濃度，從而將細胞內的氧化還原電位變為更弱的狀態。當GSH與ROS反應時，就會產生PDT抗性。因此，使用Bcl-2抑制劑會消耗癌細胞內GSH，以促進癌細胞的凋亡。

基於此，

新加坡國立大學的

劉斌教授

（通訊作者）團隊報道了

一種含有AIE PSs的無載體雜化奈米球，以同時解決ACQ、TME缺氧和內在抗氧化性的問題。

透過鐵離子（Fe3+）、TPEDCC（具有對稱二羧酸基團的AIE PSs）和Sabutoclax（具有對稱多酚基團的Bcl-2抑制劑）的自組裝即可製備該雜化奈米球（圖1）。其中，加入的Fe3+離子透過類芬頓（Fenton-like）反應產生單線態氧（1O2）和O2以克服腫瘤微環境的缺氧現象。同時，引入了Sabutoclax，以抑制Bcl-2活性，進而降低腫瘤的內在抗氧化性。透過降低GSH含量，觸發細胞色素-c的釋放和“鐵死亡”（ferroptosis），最終提高PDT的效率。

圖1、TPEDCC、Sabutoclax的化學結構以及雜化奈米球合成和作用示意圖

解析：

如圖2所示，作者以2-（（4‘-（2，2-雙（4-甲氧基苯基）-1-苯基乙烯基）-［1，1’-聯苯］-4-基］（苯基）亞甲基）丙二腈（TPEDC）為原料，快速的合成了具有對稱雙羧基的TPEDCC。接著，將TPEDCC（DMSO中為5mg mL-1）和Sabutoclax（DMSO中為5mg mL-1）分別加入到Fe3+離子水溶液中，在85℃下攪拌過夜製備該雜化奈米球。然後，作者對該奈米球進行了理化表徵，其結果如圖3所示。在超濾後，透過動態光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）證明該雜化奈米球的粒徑為50±2。6 nm（圖3A）。透過DLS在不同時間點的水溶液中研究了雜化奈米球的穩定性，發現該雜化奈米球在水溶液中可以穩定存著。利用熒光光譜發現，TPEDCC和雜化奈米球的吸收波長都在660 nm左右，未發生明顯變化（圖3B）。利用X射線光電子能譜（XPS）測量，發現奈米球中鐵離子在711。0 eV處出現特徵吸收峰，其是Fe3+（2p3/2，圖3C）。此外，高角度環形暗場掃描TEM-能量色散X射線光譜（HAADF-STEM-EDS）元素圖譜確認了納米球中C、N、O和Fe的均勻分佈（圖3D）。

圖2、合成AIE光敏劑TPEDCC的途徑

圖3、雜化奈米球的理化表徵

解析：

如圖4A所示，奈米球分解ABDA訊號的效率與自由TPEDCC相當。作者在不同pH的緩衝液中研究了雜化奈米球的體外藥物釋放行為，以模擬不同的細胞內環境。在中性環境中，藥物釋放的時間最長，而酸性條件下，超過48％的藥物在48 h內即被釋放出來（圖4B）。因此，在酸性腫瘤微環境有利於裂解弱的超分子相互作用和配位鍵，可以加速藥物的釋放。作者以MDA-MB-231乳腺癌細胞為模型，研究了其細胞攝取和體外PDT效能。如圖4C所示，將MDA-MB-231細胞與奈米球（10 μM）孵育後，紅色熒光隨時間增加，表明奈米球可被細胞內吞。在不同製劑處理後，測試了MDA-MB-231和3T3細胞的體外細胞毒性實驗。在黑暗中孵育48 h後，奈米球和TPEDCC對兩種細胞系的毒性均可以忽略不計，具有良好的生物相容性（圖4D）。當用410 nm鐳射照射細胞時，雜化奈米球對MDA-MB-231細胞的細胞毒性最強，IC50值為4。67±0。02 μM（圖4D），但是對正常3T3細胞系基本沒有毒性。此外，細胞凋亡試驗表明，奈米球在MDA-MB-231細胞中引起最高的凋亡率（61。6％）。透過共聚焦影象顯示在鐳射照射下，奈米球和TPEDCC處理的MDA-MB-231細胞組檢測到亮綠色熒光（圖4E）。流式細胞儀定量分析表明，雜化奈米球處理的細胞發出最強的綠色熒光，而無鐳射照射的組僅觀察到了非常弱的綠色熒光（圖4E）。因此，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2可以降低細胞內PDT抵抗力以提高PDT效率。

圖4、雜化奈米球的體外實驗

解析：

作者進一步對帶有MDA-MB-231腫瘤細胞的裸鼠進行體內研究，以評估影象引導的PDT療效。眾所周知，適當尺寸的奈米粒子通常具有被動靶向能力和更長的迴圈時間。在將奈米球（10 mg kg-1，200 μL）靜脈注射到荷瘤小鼠中後（圖6A），體內成像顯示在腫瘤部位積聚的奈米球訊號在4 h達到最大，並保留了該訊號長達6 h。透過組織切片分析，發現該奈米球主要作用於肝臟，組織分佈圖與體內成像結果是一致（圖5B）。體內成像結果表明，該雜化奈米球具有良好的腫瘤被動靶向能力，並具有影象引導PDT的巨大潛力。

圖5、雜化奈米球的體內實驗

【小結】

綜上所述，作者透過協調驅動自組裝，將Fe3+、AIE PSs（TPEDCC）和Bcl-2抑制劑（Sabutoclax）整合到單個奈米球體中，製備了無載體的雜化奈米球。在鐳射照射下，該奈米球表現出高ROS效率的明亮熒光，使其成為影象引導PDT的理想候選物。當腫瘤細胞內吞奈米球后，透過Fe3+的類芬頓反應增加了胞內的O2濃度。此外，沙丁酸桿菌和“鐵死亡”訊號通路可以減輕TPEDCC的細胞內PDT抗性。體外和體內實驗結果表明，多功能雜化奈米球是一種用於影象引導的增強PDT的有前景奈米平臺。參考文獻：Hybrid Nanospheres to Overcome Hypoxia and Intrinsic Oxidative Resistance for Enhanced Photodynamic Therapy 。 ACS Nano， 2020， DOI： 10。1021/acsnano。9b09032。

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