成為轉染高手，一定要知道這 4 個方法，搞清楚這 5 個問題

重新做了轉染實驗，效率還是不行，實驗一直卡在轉染這一步，導致後續實驗無法進行，我又又又 emo 了……

什麼是細胞轉染？

為什麼會出現轉染效率低？

轉染實驗應該注意什麼？

大家是否也遇到過類似的問題？不用擔心，針對以上問題我們準備了一份超級詳細的「轉染攻略」，沒有廢話，全是乾貨，一定要看到最後！

（文末還準備了福利哦）

轉染攻略之：

4 種轉染方法「頭對頭」比較

細胞轉染是指將外源分子如 DNA、RNA、蛋白質等匯入到真核細胞的技術。隨著基因和蛋白功能的深入研究，轉染已經成為科研實驗中最常用的技術手段之一。

細胞轉染技術主要分為三大類

：物理介導法、化學介導法及生物介導法，詳見圖 1。

圖 1 四種細胞轉染方法彙總

理想的細胞轉染方法應具有轉染效率高、細胞毒性小及重現性好等特點。

目前常用的轉染方法有

陽離子聚合物轉染、脂質體轉染、電穿孔和病毒感染

，不同的轉染方法各有利弊，沒有一種轉染試劑是普遍適用的，我們需要依據自己的實驗需求選擇合適的轉染技術及轉染試劑，才有可能得到理想的實驗結果。常用轉染方法的原理，特點和適用範圍詳見表 1：

表 1 四種常見轉染方法比較

轉染攻略之：

5 個問題全面解答

做轉染實驗時，除了要選擇合適的轉染試劑，要想獲得最優的轉染效果，

還需要對轉染條件進行最佳化。

細胞轉染效率往往受到很多因素的影響，比如細胞狀態和密度、培養基、質粒等，所以細胞轉染是一個常規但並不簡單的實驗。這裡我們以陽離子聚合物轉染試劑為例，一起了解一下在轉染過程中需要注意哪些因素吧！

（1）細胞狀態

細胞狀態不好，會導致轉染效率低下，為確保良好的細胞狀態需注意以下幾點：

a。 轉染實驗前，細胞解凍後傳代 3～4 次；

b。 使用活性 > 90% 的細胞，可透過臺盼藍染色等測定細胞活性；

c。 定期傳代細胞，切勿讓細胞長到匯合狀態或過度生長，多數情況下，當細胞匯合度達到 60%～80% 時轉染效率較高。

（2）使用優質 DNA

為實現高效率、低毒性的轉染，應使用高質量的 DNA（高純度、無菌、無內毒素）。

a。 使用無內毒素的試劑盒和實驗方案製備 DNA；

b。 測定 DNA 純度，OD 260/280 值應介於 1。7～1。9 之間，越接近 1。8 越好；

c。 使用無 DNA/RNA 酶的水或 TE 稀釋 DNA。

（3）載體構建

若質粒基因產物對細胞有毒害作用，則轉染難以成功。轉染載體的構建選擇可調控，強度合適的啟動子很重要，可以以空載體或相同載體的其他基因為對照排除毒性對細胞的影響。

（4）最佳化轉染試劑/DNA 的比例

不同細胞系轉染效率通常不同，需要進行預實驗，選擇合適濃度的 DNA，調整 DNA 與轉染試劑的比例，以獲得較高的轉染效率。

（5）防止汙染

細胞汙染也會造成轉染效率低下，為防止細胞汙染應注意：

a。 培養物汙染

培養物可被細菌、真菌、病毒、支原體或其他細胞種類所汙染，各種汙染均會導致結果錯誤。

b。 支原體汙染

支原體汙染一般難以察覺，培養的細胞被支原體汙染後，幾乎可以改變細胞的所有功能，包括酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結構，以及轉染效率。因此，必需進行支原體汙染的常規篩查。

c。 交叉汙染

如果同一個實驗室同時培養不同種類的細胞，那就有可能發生交叉汙染。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養細胞種，幾個月過後它們就會完全取代目標培養物。當懷疑有交叉汙染時，如果有可能，就換用新鮮的，傳代次數少的細胞源。

轉染攻略之：

2 個方法助力效率驗證

轉染完成後需要對轉染效率進行驗證，常用的轉染效率驗證方法有以下兩種：

1、利用含 GFP 或 RFP 之類報告基因的質粒作為陽性對照，評估轉染效率。

使用熒光顯微鏡或流式細胞儀可以測定轉染細胞和 GFP 蛋白表達細胞的百分比。

a。 轉染後 24～48 小時，即可以檢測到質粒的表達。

b。 陽性對照可以放在一個單獨的孔中，或是與目的質粒共轉染。

2、利用 qPCR 法精確定量目的基因。

選擇合適的轉染試劑，並進行規範操作，老闆再也不用擔心你的細胞轉染效率低了！