高中生物試題中引物及T-DNA的應用
基因工程中，選用
兩種不同的限制性核酸內切酶
（限制酶）分別對目的基因和載體進行處理，使得二者末端分別帶上不同的粘性末端，該過程的目的，一來是為了
避免目的基因和載體的自身環化
，二來是
保證目的基因與載體連線方向的正確性
（
目的基因的定向連線
）。
紅色三角代表啟動子啟動的轉錄方向，黑色箭頭表示是目的基因的方向，基因的首端需接在質粒啟動子之後，若基因反接，則轉錄出的mRNA與原mRNA鹼基互補配對，該RNA稱為反義RNA，可下調目的基因的表達量。
對於質粒，要想實現上述過程的正確連線並不難，現應用的質粒或其他載體都是改造過的，
具有多克隆位點（MCS
，一段DNA片段，內含有多種酶的酶切位點），便於目的基因的插入。
若目的基因兩側沒有合適的酶切位點，可
利用PCR過程向目的基因兩側新增酶切位點
，以實現上述過程，對應引物片段及結構如下：
很多學生不太理解為何在引物末端存在遊離
單鏈片段
時，PCR擴增之後所獲得的片段沒有粘性末端，這裡用圖解的形式解釋一下。
（黃色為親代DNA，藍色為第一次複製後形成的子鏈，紫色為第二次複製形成的子鏈，青藍色為第三次複製形成的子鏈）
據圖可知，
PCR經過三次迴圈
之後，會
第一次出現所需要的的DNA片段
，且
末端存在引物中新增的酶切序列
，隨後繼續進行擴增，即可實現目的DNA片段的指數形式擴增。
上述過程主要需要掌握幾個點：
1、引物的意義在於提供3’-OH，用於子鏈延伸，只要保證引物的3’-OH及該末端一段序列可以和模板鏈鹼基互補配對，子鏈延伸便可以完成；
2、一般情況下，子鏈延伸中，只要時間足夠、原料充足，最終會延伸至模板鏈的末端，子鏈延伸不會中途停止（當目的片段較大時可能會造成不能完整擴增）；
3、PCR的最終產物，雖然有大小不同的片段存在，但完整目的基因佔絕對優勢，可透過電泳後分離獲得。
定點突變技術
自發突變和誘發突變具有
不定向性和隨機性
，若想要研究
某一鹼基對的替換、增添或缺失對基因功能的影響，或替換蛋白質中某個氨基酸實現對蛋白質的改造
，通常會利用PCR技術對基因進行編輯，實現
定點突變
。
（AUG為起始密碼子，決定甲硫氨酸；ACC決定蘇氨酸；GCA決定丙氨酸）
透過分步PCR可大量擴增得到兩個鹼基對發生替換的目的基因，實現定點突變，使得
肽鏈
中的蘇氨酸轉變為丙氨酸。
T-DNA相關
構建轉基因植株的過程中，常用
農桿菌轉化法將目的基因匯入植物細胞
，本方法的優點在於
Ti質粒中的T-DNA可轉移至植物細胞並整合到染色體DNA上
，從而實現目的基因穩定存在於植物的
基因組
中。
當植物根部被昆蟲啃咬或出現損傷時，會釋放酚類物質，農桿菌感知該訊號並做出相應，合成相應蛋白，將自身Ti質粒的T-DNA片段切離質粒，並在特定蛋白質的作用下使其轉移至植物細胞中。
進入植物細胞的T-DNA
，與蛋白質結合形成
DNA-蛋白質複合物
，透過
核孔
進入細胞核並插入至
染色體DNA
上。
鑑於上述過程，可將
相應的目的基因插入至T-DNA上，透過感受態轉化法轉化農桿菌，使其具有重組Ti質粒
。用該農桿菌侵染植物愈傷組織，實現將目的基因匯入植物細胞中，如下：
這裡要尤為注意，農桿菌侵染植物細胞時，並不是
Ti質粒
全部進入植物細胞，
只有T-DNA進入
，因此要明確審題和讀圖，確定給定的
抗生素抗性基因
或其他標記基因是否存在於T-DNA上。
上述過程可用於
製備植物突變體
，為
確定被插入位點的基因及基因序列
，可以利用T-DNA設計部分引物，用於
基因型判定、基因測序
等。
若已
清楚T-DNA的插入位點
，則可以透過設計引物
確定植株的基因型、確定插入位點、確定T-DNA是否為單複製插入
。
設計併合成
D基因的特異性引物引物P1、P3
、
T-DNA的特異性引物引物P2
，提取轉基因植株基因組，若
P1、P3引物組合可擴增出條帶
，則該植株具有
D基因
；若
P1、P2引物組合可擴增出條帶
，則該植株具有
d基因
（D插入突變後稱為d基因），運用擴增結果的不同組合，即可判斷該植株內是否存在T-DNA。
通常T-DNA的插入位點是隨機的，
在未確定插入位點的情況下，運用相應技術可對插入位點基因進行相應研究
，如下：
如上圖，用限制酶進行酶切，將所得含部分T-DNA序列的片段與運載體連線構建重組質粒，用質粒特異性結合引物P2和T-DNA序列內的特異性引物P1進行擴增並測序，可得插入位點基因的部分
鹼基序列
，隨後運用
DNA分子雜交技術
即可判斷出基因在染色體上的位置、獲取完整基因等。
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