熒光定量-引物設計少不了

上次介紹了引物設計，這次分享設計出來的引物如何驗證。

引物驗證三部曲

先了解一下定量引物需要滿足哪些要求吧！

重中之重就是

特異性

！

其次是引物

不要存在二聚體

！

最次要的就是引物是否

跨內含子區段

！

瞭解了引物的要求，現在介紹引物驗證三部曲！

第一部曲！

先利用網站檢視特異性！有兩個適用於玉米的網站！

首先必不可少的介紹NCBI

1

這個網站可以用來設計引物，但我沒使用過這個，我只用來驗證。

怎麼做呢？輸入上下游引物，設定退火溫度，按照設計引物時候的退火溫度設定就成，不改也行。

2

關於跨內含子這一點，我勸大家看開點，不要太執著。跨內含子就是為了避免結果受到基因組的汙染。所以呢，只要好好的去基因組DNA，就放過它，也放過自己。

物種那裡是需要輸入的，比如：zea mays（taxid：4577），一般只輸入zea就會有選擇框出現了。

3

點執行後，會出現上圖，耐心等待。

4

我隨便找了一個基因，分析下怎麼看待結果！

1號事實上就是靶定在我們設計的片段上的引物，

2號也在目的片段上，但這不是我們想要的

3號是在其他基因上的非特異性擴增

上述情況如果只出現1和2這種產物的擴增長度差異非常大的情況，可以試一下。透過PCR跑膠看膠圖，就可以知道491的這一條能不能擴增出來了。

但是當出現了3號這種情況，那這一條就可以捨棄了。基本上沒有辦法判斷是否可以特異擴增1號。

5

出現上圖這種狀況的時候，可以算是特異了，長片段在定量裡是擴不出來的！定量的過程中的延伸只有15s，也就擴增500bp左右。

還會出現一種狀況，出現no target，那可能是下載的序列和NCBI收錄的序列不一致。

另一款網站，你值得擁有！

6

輸入上下游引物，可以多個一起檢測。這裡只用一對來解釋結果。

7

然後點選RUN，就可以了。

結果怎麼看呢？

8

Dimer list ：出現這種情況，P2和P2的二聚體，實在沒有其他的引物，可以試試。

9

這個網站和NCBI非常相似，運算機制存在某些差別，但判斷引物是否可行的依據是相通的。

我一般會結合二者，列出所有可能可以作為定量的引物的列表，最後再從這裡面挑選最好的兩個去進行下一步PCR驗證。

第二部曲留給明天！