引物合成的步驟

殺螟腈怎麼合成

引物合成是指透過測定引物的OD值，溶解引物，最終合成引物的一個完善的過程。目前引物合成基本採用固相亞磷醯胺三酯法。亞磷醯胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷醯胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸透過3′→5′磷酸二酯鍵連線。

合成過程

第一步是將預先連線在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得遊離的5′-羥基。

第二步，合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

第三步，帶帽（capping）反應，縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應（少於2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這種短片段可以在後續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。引物合成圖

引物合成圖

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連線到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。透過氨水高溫處理，連線在CPG上的引物被切下來，透過OPC， PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮，脫鹽，沉澱。沉澱後的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。

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