miRNA靶基因驗證

一、樣品準備：

1、質粒轉染細胞

（1）細胞鋪板：將細胞按50%的密度接種到細胞培養12孔板內。

（2）轉染：16h左右細胞約70%時轉染螢光素酶報告基因質粒，每個樣品設定3個復孔。首先設計四組：

空白組（轉染試劑+細胞）

質粒組

質粒+miRNA NC組

質粒+miRNA mimics組

● 配製質粒組：按照每空50ng質粒，同時每孔20ul無血清培養基計算需用量，標記為A。

● 配製miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics的終濃度為20nM，同時每孔20ul無血清培養基計算需用量，分別標記為B、C。

● 配製對應轉染試劑：按照每孔0。5μL轉染試劑，同時每孔20ul無血清培養基計算需用量，標記為D。

● 稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。

● 將稀釋好的質粒DNA和miRNA mimics分別和對應轉染試劑混勻，常溫孵育20min。

● 將2。4步驟中試劑對應加入孔中。

● 轉染6h後，換新鮮完全培養基。

2、雙報告基因檢測

（1）質粒共轉染36-48h後，棄去培養基，用100μL 1XPBS清洗細胞。

（2）傾斜12孔板，吸乾剩餘的PBS。

（3）去離子水將5XPLB（裂解液）稀釋成1XPLB（現配現用），使用前放到常溫。

（4）每孔加50μL稀釋好的 1X PLB，置搖床振搖20-30min以保證裂解緩衝液完全裂解細胞。

（5）選用白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10μL， 加入100μL預先混好的Luciferase Assay Reagent II，2s後測資料，檢測熒光素酶反應強度。注意此步需在避光條件下進行。

（6）測定結束後，每孔新增100μL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s後，測資料，檢測內參海腎熒光素酶反應強度。

（7）記錄讀數：每個樣品會有3個數值：RLU1—螢火蟲熒光素酶反應強度， RLU2—內參海腎熒光素酶反應強度，計算兩組資料比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析資料：比較1、2組可以發現由於對照組未轉染質粒，因此檢測不到熒光素酶反應強度。比較3、4組，由於轉染microRNA mimics進行microRNA的過表達，螢光素酶的活性降低，提示microRNA可能參與抑制靶基因的表達，需要結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

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