實驗技術（2）——引物設計相關
原創作者名稱變更說明之前使用過Reappear和Gleason，以後的推文都使用G.S. Zhao，其實這三個名稱都是我。【進入正題】
前面提到的幾個探究蛋白互作相關的實驗，其實第一步都需要構建合適的質粒，那麼就少不了設計靠譜的引物了。
通常來說，引物的設計需要遵守一些基本的原則。這些原則很細，很多，也很繁瑣。但實際上對於常規的引物，並不需要考慮太多，達到實驗目的即可，更多的情況下需要靈活選擇。
一般來說，引物設計需要遵循以下原則：
1。 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應。2。 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。3。 引物3’端的末位鹼基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為A的錯配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應當避免在引物的3’端使用鹼基A。另外，引物二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。4。 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。5。 引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T）。6。 ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應。7。 引物二聚體及髮夾結構的能值過高（超過4。5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。8。 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。
但是在實際設計過程中，往往很難同時滿足以上條件，因此只需要在設計引物時儘可能滿足即可，沒必要太過糾結。
同時需要注意，各種模板的引物設計難度不一，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，儘量去滿足條件。
下面主要介紹以下兩方面的引物設計。
1 點突變引物設計
2 qPCR引物設計
（常規引物的設計思路在已經提到，這裡不再重複。）
1 點突變引物設計
在蛋白質功能研究過程中常常對其關鍵的酶活位點、修飾位點進行突變，透過點突變來研究基因中發揮關鍵功能的是哪一個結構域，甚至具體到哪一個氨基酸。因此就需要設計點突變引物。
點突變主要的原則就是透過儘量突變較少的鹼基數目而使氨基酸發生更改。由於氨基酸密碼子第三位具有簡併性，一般不需要進行突變，因此至多突變兩個鹼基即可。
1.1單點突變引物設計
比如，將下圖中的
Ser
突變為
Ala
。
首先，查詢編碼Ala的密碼子：為
GCA/GCT/GCG/GCC
，根據改動最小原則，我們選擇將其突變為
GCC
，則只需要改動1個鹼基，即
TCC→GCC
。
設計引物（分兩種情況）：
情況一：構建點突變質粒只需下面這一對引物即可。F-S241A：TGTACACATTGTCA
CGG
ACGTACCCGCCGTR-S241A：ACGGCGGGTACGT
CCG
TGACAATGTGTACA
可以看到黃色部分為需要突變的氨基酸，紅色的鹼基為突變鹼基，兩邊各延長一部分完全與模板互補配對的鹼基。
但是發現兩條引物完全互補配對，看似違反了前面所講的原則，但實際上是針對質粒點突變精妙的設計。兩條引物有一定機率與模板匹配，此時便會按5‘-3’方向完整擴增一圈整個環狀質粒，最終形成突變質粒的構建。情況二：只對目的基因進行點突變則除了需要情況一中的兩條引物，還需要在目的基因兩端選取F和R。如下圖：
1.2同時對多個位點進行點突變
針對單點突變，手動選取即可完成，但對於多位點突變就不能蠻幹了。這裡分享一個線上點突變引物設計的網址：
https：//www。agilent。com/store/primerDesignProgram。jsp
該網站可以設計單點和多點突變引物以及刪除或者插入一段DNA序列（ 插入時只能插入小的DNA片段）。可以同時設計針對7個氨基酸的突變引物。
進入頁面：
引數說明：
比如，我們對以下3個位點進行點突變。
從結果可以看到引物的長度、Tm值及引物與模板相互匹配的序列。
1.3缺失一段序列
比如缺失下圖中67-114之間的序列，（注意：第67位和114位這兩個氨基酸不會被刪除，實際刪除66-113這段氨基酸序列）。
小結：一般在單點突變和缺失一段序列時，成功率比較高；多點突變時可能就需要多次嘗試並檢測了。
2 qPCR引物設計
Q：qPCR引物設計的問題點：
A：SYBR Green與雙鏈DNA結合後會產生熒光，如果反應體系中有非特異性擴增或者引物二聚體存在，也將被檢測到，導致實驗結果的不準確。
因此設計合適的qPCR引物就很關鍵。
qPCR引物設計的一般原則：
引物應在核酸系列保守區內設計並具有特異性。
擴增產物長度在80-150 bp。最長不要超過300 bp。
產物不能形成二級結構。
引物長度：一般在17-25鹼基之間，上下游引物不宜相差太大。
引物自身避免形成髮卡結構。
引物之間避免形成引物二聚體。
引物 G+C含量在40%～60%之間，45-55％最好。
引物Tm值在58-62度之間，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超過5度。
其實這裡qPCR引物的設計和常規PCR的設計也是大同小異。和常規引物設計一樣，並不能死磕原則，靈活選擇更為重要。
這裡可以使用以下軟體和線上網站進行設計：
1。
Primer Premier 5.0
設計方法和常規引物設計一樣，只需根據實驗需求設定幾個必要引數即可。這裡不進行演示。
2。
NCBI Primer blast
：
https：//www。ncbi。nlm。nih。gov/tools/primer-blast/
3。
Primer3
：
https：//bioinfo。ut。ee/primer3-0。4。0/
下面對NCBI Primer blast和Primer3進行簡單介紹。
NCBI Primer blast
同樣，我們選擇P53這個基因。點選Pick Primer進入
NCBI Primer blast
介面。
可以看到，上一步選擇的p53序列已經載入進來。
接下來看一下介面中幾個重要的引數設定。
結果如下：
最後，選擇最優引物即可。
Primer3
Primer3屬於傻瓜式操作，各引數已自動設定，基本無需更改，貼上序列後直接提交即可。
但這裡需要思考一個問題：是否排名第一的引物對一定最優呢？不一定。由於這些引物是未考慮非特異性擴增的。因此在得到候選引物對後，最好還是靈活選擇。以便得出最優的引物對，確保實驗的準確性。
除了上述線上網址外，給大家推薦以下軟體和線上網址，助力解決點突變、qPCR等引物設計的各種問題。具體的使用問題各位可以自行摸索，都很簡單，基本上開啟就可以使用
1.BioXM
2.http://www.bioinformatics.org/primerx/index.htm
3.https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/
（qPCR引物資料庫qPrimerDB，收錄了包括66種重要植物（擬南芥、水稻、玉米、大豆、馬鈴薯等）等在內的147個物種共3331426個基因的51091785對qPCR引物。）
