Y2H-seq 揭示不老松年齡的秘密——酵母雙雜交還可以這麼用？？

眾所周知，酵母雙雜交技術是研究蛋白相互作用的利器。目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是透過酵母雙雜交技術發現的。但是做過酵母雜交實驗的小夥伴也都知道蛋白篩選較容易，但是篩選後，想知道獲得的陽性克隆都對應的是啥基因，所花費的人力物力相當不小。有困難解決困難，勇敢牛牛不怕困難。小歐從2018年即開始關注酵母雜交與高通量測序相結合的技術發展，如2017年Cao Gang老師等發表的RLL-Y2H技術，實現了文庫篩文庫可能，該技術透過對酵母雙雜常用載體的改造，並結合高通量測序，可直接獲得AD-BD互作蛋白對。所用方法相當巧妙，感興趣的同學請點選《當酵母雙雜交遇到高通量測序》。

今天小歐又給大家帶來了一篇酵母雙雜交結合高通量測序技術的應用文章。北京林業大學鈕世輝老師團隊，在傳統的酵母雙雜交技術流程基礎上，巧妙的結合了NGS技術，最佳化建立了Y2H-seq技術，大大縮短了常規的篩庫後測序驗證週期，節約了實驗成本。文章中應用Y2H-seq技術，對不老松年齡密碼進行了有趣的研究，其中所用酵母雙雜交文庫由歐易生物協助完成。

鈕老師團隊之前的研究已經鑑定了DAL1作為一種保守的針葉樹年齡生物標記基因，在油松從營養生長到生殖生長的時相轉變過程中起重要作用。《專案文章 | Plant Physiol：北京林業大學發現針葉樹年齡訊號的調控機制》。

為了進一步理解年齡效應如何驅動針葉樹的發育，闡明與DAL1相關的蛋白互作網路很關鍵。鈕老師團隊利用傳統的Y2H篩選技術結合NGS測序技術，最佳化得到了Y2H-seq技術，與傳統的篩選測序相比，大幅度節省了時間和實驗成本。透過該技術，本研究獲得了DAL1相關的蛋白互作網路，並結合生信分析，構建了一種新的針葉樹老化途徑的調控模型，對針葉樹年齡調控機制研究及優良針葉林木繁育技術研發提供了重要參考。其主要的實驗路徑如下（圖1）&darr；&darr；

透過傳統的酵母雙雜交系統，以PtDAL1為誘餌，篩選樣本來源於不同年齡段的油松cDNA文庫。

將獲得的陽性克隆，10個一組，挑選到1個96孔板的PCR板孔中，獲得10*96個陽性克隆的96孔板。以其中陽性克隆mix為模板，進行PCR擴增，並將所有的PCR產物進行純化。

使用純化後的PCR產物，進行打斷後構建二代測序文庫，透過NGS測序，獲得6G的陽性克隆資料。

透過分析二代測序資料，獲得陽性克隆基因資訊（去冗餘後獲得135個互作子，包含21個TFs，2個TRs及酶類、熱激蛋白、RNA結合等蛋白，部分見表1）。

挑選重要的候選基因進行一對一驗證（圖2）。

與擬南芥中同源基因AGL6 的蛋白互作網路進行比對分析。

對DAL1互作蛋白（DIPs）的基因表達譜、啟動子中的順勢作用元件功能進行分析，並對DIPs進行GO註釋（圖3）。綜合生信分析結果，構建針葉樹老化途徑的調控模型（圖4）。

圖1。 Y2H-seq技術流程圖

表1。 PtDAL1 互作蛋白註釋（部分）

圖2。 PtDAL1 互作蛋白 Y2H 驗證

圖3。 PtDAL1 互作蛋白的GO功能分析

圖4。 PtDAL1介導的油松生長與發育調控預測模型

總結

本研究透過Y2H-seq技術鑑定了135個高可信度的油松PtDAL1直接相互作用蛋白，結合已有資料庫及研究背景，構建了PtDAL1介導的油松不同年齡階段的生長髮育調控模型。對苗期生長緩慢的針葉樹育種具有重要意義。

參考文獻

Chen X， Zhu Q， Nie Y， et al。 Determination of conifer age biomarker DAL1 interactome using Y2H-seq。 Forestry Research 2021； doi：10。48130/FR-2021-0012。

Ma J， Chen X， Song Y， et al。 MADS-box transcription factors MADS11 and DAL1 interact to mediate the vegetative-to-reproductive transition in pine。 Plant Physiology 2021； doi： 10。1093/plphys/kiab250。