非靶向代謝組學揭示東方甜瓜發育過程中糖和有機酸關鍵調控網路

前言

2022年5月，歐易/鹿明生物合作客戶甘肅省農業科學院

程鴻團隊

和中國農業大學

林濤團隊

在

Frontiers in Plant Science

期刊發表的題為

“Identification of Key Gene Networks Controlling Soluble Sugar and Organic Acid Metabolism During Oriental Melon Fruit Development by Integrated Analysis of Metabolic and Transcriptomic Analyses”

的研究成果，採用

非靶代謝組學和轉錄組

研究方法，發現了蔗糖、D-葡萄糖、棉子糖的高積累以及相對較低的檸檬酸和蘋果酸可能有助於東方甜瓜“甜寶”的甜味。

“小翠瓜”品種促進葡萄糖和果糖轉化為下游過程（如糖酵解）的中間化合物。三羧酸 （TCA） 迴圈增強，從而導致可溶性糖和有機酸的差異積累，最終導致兩個東方甜瓜品種之間的味道差異。為進一步探索甜瓜中可溶性糖和有機酸的代謝機制提供了重要資訊。

中文標題：

透過代謝和轉錄組分析的綜合分析鑑定控制東方甜瓜果實發育過程中可溶性糖和有機酸代謝的關鍵基因網路

研究物件：

甜瓜

發表期刊：

Front。 Plant Sci。

影響因子：

5。753

發表時間：

2022 年5月12日

合作單位 :

甘肅省農業科學院蔬菜研究所，中國農業大學園藝學院

運用生物技術：

非靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術支援）、轉錄組學（由歐易生物提供技術支援）

研究背景

東方甜瓜 （ Cucumis melo var。 acidulus ） 屬於葫蘆科，是一種甜而芳香的甜瓜，在世界範圍內廣受歡迎。由於缺乏儲存的澱粉儲備，甜瓜果實在發育過程中需要同時供應來自葉子的光同化物來積累糖分。因此，東方瓜是研究光同化物動態變化的有吸引力的模型。甜度是甜瓜感官質量評估中的一個重要特徵，由果實的代謝物組成決定，例如糖和有機酸。在甜瓜中，蔗糖是決定果實品質的主要成分；此外，糖與有機酸的比例對水果品質有顯著影響。迄今為止，已經使用轉錄組測序、基因組工具和功能分析對甜瓜中的蔗糖和有機酸積累進行了各種研究，其中大多數只關注少數酶活性。因此，針對甜瓜果實糖份和有機酸相關的代謝和分子機制的系統研究具有重要意義。

近年來，基於

多功能“組學”方法

的綜合分析為識別基因網路及其在生命系統中的調控機制提供了一種有效的手段。特別是

轉錄組和代謝組的聯合分析

已被廣泛用於識別控制植物果實中糖和有機酸積累的訊號通路和機制。然而，這些綜合研究闡明瞭控制糖分的關鍵基因網路香瓜果實中缺乏有機酸調節。對比品種的比較分析為鑑定控制果實品質的重要性狀提供了一種有前景的方法。

在本研究中，透過全面的

轉錄組分析和代謝物分析

，作者發現東方甜瓜品種‘甜寶’（A）的果實含糖量高，‘小翠瓜’（B）的果實含糖量低，並同時在不同的發展階段進行了比較。研究有助於闡明與甜瓜中糖和

有機酸代謝

相關的基因的動態和差異表達。

研究思路

研究結果

兩個東方甜瓜品種不同成熟期果實的總可溶性固形物和總酸

在三個成熟階段收穫兩個東方甜瓜品種的果實，以研究果實中總可溶性固體（TSS）和總酸的變化（圖1A）。隨著果實發育，A、B品種的TSS持續積累，在S3到達峰值。［S1，開花後7天第一階段（DAA）；S2，13 DAA；和 S3， 25 DAA］，但 A 的每個階段的 TSS 水平顯著高於 B （圖1B）。此外，A果實不同發育階段的總酸沒有顯著差異，而隨著B果實的成熟，總酸明顯增加（圖1C）。TSS 和總酸的差異解釋了這兩個品種的天然甜度之間的差異。

圖1 | 兩個甜瓜果實在連續成熟階段的變化。

a）香瓜品種A、B不同發育階段果實圖片，果實樣品採集階段分別為S1（7 DAA）、S2（13 DAA）和S3（25 DAA）。

b）三個成熟階段果實中的 TSS。

c）三個成熟階段果實中的總酸。值是平均值 ± 標準誤差 （SE） （ n = 3），條形表示 SE。列之間的顯著差異用不同的字母表示（p < 0。05）。

代謝物分析和代謝物差異積累

對於代謝物分析，作者對

非靶代謝組學測定

，共檢測到 4，346 種代謝物。根據所有檢測到的代謝物的投影中變數重要性（VIP）> 1和p <0。05的篩選標準，在不同的比較組中共研究了961種差異累積代謝物（DAM）（表1）。在 A 果實 （AF） 與 B 果實 （BF） 的相同成熟階段，發現 S3 的 DAM 比 S1 和 S2 更豐富，這意味著 DAM 的主要變化發生在 S3。隨後，利用京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析進一步瞭解與兩個東方甜瓜品種相關的生物學機制。其中，參與蔗糖和有機酸代謝的代謝物在果實中的積累差異更大，包括“半乳糖代謝”、“磷酸戊糖途徑”、“果糖和甘露糖代謝”、“亞油酸代謝”和“花生四烯酸”。

表1 | 兩個甜瓜品種 A 和 B 果實中差異積累代謝物的比較

進一步選擇水果中任一對照組中倍數變化（FC）值≥2且FC≤0。5的差異丰度糖代謝物，並在熱圖中顯示其變化模式（圖2）。正如預期的那樣，大多數糖代謝物從 AFS2 開始呈上升趨勢，並在 AFS3 達到峰值，並且與 BFS3 相比，它們在 AFS3 中的積累更多，例如 D-麥芽糖、半二糖、蔗糖和 D-（+）-棉子糖。結果表明，更豐富的糖代謝物可能對 A 類水果的甜味至關重要。作者發現 D-果糖在 S2 中逐漸增加，然後在 A 和 B 中的 S3 中減少，BFS3 中的值比 AFS3 高 2。0 倍。A 和 B 水果中的 6-磷酸果糖持續下降。

圖2 | 甜瓜品種 A 和 B 三個果實發育階段糖代謝物 DAM 熱圖。

三個“A”果實發育階段為 AFS1、AFS2 和 AFS3，三個“B”果實發育階段為 BFS1 、BFS2 和 BFS3。在 AF 和 BF 的任何比較組中，基於 FC 值 ≥ 2 和 FC 值 ≤ 0。5 選擇 DAM。FC 值顯示在熱圖中，它使用 BFS1 的資料作為校準物，而帶星號的代謝物使用 AFS2 的資料作為對照

作者還評估了水果中任何一個對照組中 VIP > 1 和p < 0。05的有機酸的 DAM ，並在熱圖中顯示了變化模式（圖 3）。隨著果實成熟，A和B中蘋果酸的積累不斷減少。檸檬酸水平在AFS2和BFS3中增加並達到峰值。N-氨基甲醯腐胺在 AF 的任何階段均未檢測到，但在 BFS3 中顯著積累。在 S2 和 S3 階段，豐富的有機酸積累到高水平。

圖3 | 甜瓜品種 A 和 B 三個果實發育階段有機酸 DAM 熱圖。

三個“A”果實發育階段為 AFS1、AFS2 和 AFS3，三個“B”果實發育階段為 BFS1、分別為 BFS2 和 BFS3。DAM 是根據水果中任何比較組中的VIP > 1 和p < 0。05 選擇的。FC 值顯示在熱圖中，它使用 BFS1 的資料作為校準器

轉錄組分析和差異表達基因

為了鑑定不同發育階段果實中的差異表達基因（DEGs），作者使用了

轉錄組學測序技術

。使用p < 0。05 和 FC 值 > 2 的閾值，在六組中共鑑定出 14，703 個 DEG。在所有比較組中，BFS3 與 BFS1 中累積的 DEG 最多。BFS3 與 BFS1 中共有 1，113 個 DEGs 唯一表達，這表明西瓜品種 B 果實中相當一部分的轉錄組變化發生在成熟過程中。

不同比較組中 DEG 的 KEGG 分析提供了有關豐富的生物途徑。在整個葉片和果實發育過程中，明顯富集的通路包括“碳代謝”、“光合生物中的碳固定”、“植物激素訊號轉導”和“光合作用-天線蛋白”顯著富集 （ q -值 ≤ 0。001）。此外，在 AFS2 與 BFS2、AFS3 與 BFS3 和 AFS3 與 AFS1 中，“聚酮化合物糖單元生物合成”極其豐富（q值 ≤ 0。001）。“澱粉和蔗糖代謝”和“氨基糖和核苷酸糖代謝”（q-value ≤ 0。001）明顯富含在 BFS2 與 BFS1中。

表2 | 兩個甜瓜品種果實的 DEGs 統計

水果中的組合代謝組學和轉錄組學分析

為進一步探討甜瓜果實基因表達與代謝物積累之間的關係，對AF與BF進行了相關性檢驗和聯合生物學註釋。透過

結合代謝組學和轉錄組學資料

，作者確定了與糖和有機酸代謝相關的常見改變的 KEGG 途徑，並確定了 A 和 B 水果之間的 DEG 和 DAM（圖 4）。在所有三個比較組（AFS1 與 BFS1、AFS2 與 BFS2 和 AFS3 與 BFS3）中，“澱粉和蔗糖代謝”和“氨基糖和核苷酸糖代謝”包括更多的 DEG，而“戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化”（ AFS1 與 BFS1）和“糖酵解/糖異生”（AFS2 與 BFS2 和 AFS3 與 BFS3）是第三豐富的途徑。在常見的 KEGG 通路分析中，共發現了 10、20 和 19 個與糖和有機酸代謝相關的 DAM。

Pearson 演算法用於計算前 100 個 DEGs 和 DAMs 之間的相關性。從相關性分析的響應強度資料中，發現了與糖和有機酸代謝相關的 DEGs 和 DAMs 的網路分析，並在 AFS2 vs。 BFS2 和 AFS3 vs。 BFS3 中直觀地說明了相互關係（圖 5）。AFS2 與 BFS2 中的 DAM，例如蔗糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-（+）-棉子糖、檸檬酸和蘋果酸，受到 DEG 的正向或負向調節。

AFS3 與 BFS3 中蔗糖的積累受編碼異檸檬酸脫氫酶 （IDH， MELO3C025076。2） 和 ACO1-1 （MELO3C014437。2） 的基因負調控，而 AFS3 與 BFS3 中蘋果酸的含量受到正調控透過編碼 NADP-ME （MELO3C011129。2）、PDC1 （MELO3C009145。2）、ACO1-1 （MELO3C014437。2） 和 IDH （MELO3C025076。2） 的基因。上述 DEGs 和 DAMs 可能是導致兩個甜瓜品種 A 和 B 之間差異的重要因素。

圖4 | 與糖和有機酸相關的 KEGG 途徑的轉錄組和代謝組的綜合分析。

AFS1 與 BFS1、AFS2 與 BFS2 和 AFS3 與 BFS3 三個比較組。條形圖左側提供了 KEGG 通路的具體名稱，條形右側提供了相關 DEG 和 DAM 的數量。

圖5 | 參與糖和有機酸代謝的 DEG 和 DAM 的相關網路。

a）AFS1 與 BFS1，綠色圓圈表示基因，橙色圓圈表示代謝物。以“紅色”和“綠色”著色的線分別代表正相關和負相關

b）AFS2 與 BFS2，綠色圓圈表示基因，橙色圓圈表示代謝物。以“紅色”和“綠色”著色的線分別代表正相關和負相關

c）AFS3 與 BFS3，分。綠色圓圈表示基因，橙色圓圈表示代謝物。以“紅色”和“綠色”著色的線分別代表正相關和負相關

兩個甜瓜品種中可溶性糖代謝，有機酸代謝相關的候選基因

一些與可溶性糖代謝相關的重要基因被發現存在差異表達，並且可能對兩種甜瓜品種在果實發育的不同成熟階段的不同甜度產生相當大的影響（圖6）。醛糖 1-差向異構酶（ galM ） 基因在 AFS3 中的表達高於在 BFS3 中的表達。肌醇3-α-半乳糖基轉移酶（GOLS ）基因在AF中表現出持續下降，但在BF中表達先下降後上升，BFS3中的FC值是AFS3中的17。3倍。二棉子糖合酶（RS） 基因和兩個轉化酶（ INV ） 基因在不同的 AF 階段顯示出比 BF 相對更高的表達。與 AF 相比，BF 中的兩個蔗糖合酶（ SS ） 基因、己糖激酶（ HK ） 基因、UDP-葡萄糖 4-差向異構酶（ UGE ） 基因和果糖激酶（ FK ） 基因被發現上調。

此外，與 BFS3 相比，兩個1-磷酸葡萄糖腺苷酸轉移酶（ glgc ） 基因和兩個1，4-α-葡聚糖分支酶（ GBE ） 基因在 AFS3 中的表達更高。相比之下，兩個海藻糖6-磷酸磷酸酶（ TPS ）基因、2個α-半乳糖苷酶（ GLA ）基因和3個甘露糖-6-磷酸異構酶（ MPI ）基因在BFS2或BFS3中的表達高於AF的同一階段。此外，SWEET10 的表達在 AFS2 和 AFS3中強烈且顯著上調，這意味著 SWEET10 在糖轉運和積累中起主要作用。

結合DEG鑑定、相關性分析以及與有機酸代謝相關的DEGs和DAMs的共同KEGG通路分析表明，一些與有機酸代謝相關的候選基因在兩個甜瓜品種中表現出顯著差異（圖6）。其中，AF中的大部分基因呈現增加趨勢，並在AFS2［如NADP-ME和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（ PEPCK-2 ）基因］或AFS3（如ACO1-1和PDC1 ）中達到峰值。相比之下，BF 中的大多數基因在 BFS3 中上調並達到峰值。例如，ACO1-1、PDC1和NADP-ME。有趣的是，與 BFS3 相比，BFS3 中的所有這些基因都更加豐富。

圖6 | 兩個甜瓜品種果實中不同的可溶性糖和有機酸生物合成途徑。

酶名稱旁邊是它們在甜瓜果實中不同成熟階段的表達模式。表達模式由倍數變化值反映，該值使用 BFS1 的資料作為對照。

其他候選基因操縱兩個甜瓜品種的不同成熟行為

為了分析控制兩個甜瓜品種成熟過程的其他因素，發現一些與乙烯訊號轉導相關的關鍵基因存在差異表達（表3）。乙烯反應感測器1 （ ERS1 ）基因的表達隨著AF的成熟而逐漸降低，而隨著BF的成熟，其表達先升高後降低，並在BFS2達到峰值。兩種乙烯反應性轉錄因子（ ERFs ） 在 AFS1 中的表達高於 BFS1，但在 BFS2 和 BFS3 中高表達。此外，絲裂原活化蛋白激酶 6 （ MPK6） 同源基因在 A 和 B 品種果實成熟時均受到抑制，但在 BFS2-BFS3 中的表達量遠高於 AFS2-AFS3。

為了研究類胡蘿蔔素生物合成的途徑，一些類胡蘿蔔素代謝相關基因被鑑定並在AF和BF之間顯著差異表達（表3）。八氫番茄紅素合成酶（PSY）基因隨著AF成熟持續降低，在BFS2時升高並達到峰值然後降低，此外，類胡蘿蔔素裂解雙加氧酶 （CCD）基因在 A 和 B 中均隨著果實成熟而急劇增加。

表3 | 乙烯訊號轉導和類胡蘿蔔素代謝相關的 DEGs 資訊。

透過定量實時 PCR 驗證候選 DEG

為了驗證作者的 RNA-seq 分析中 unigenes 的相對錶達模式，作者選擇了 12 個與可溶性糖和有機酸代謝相關的關鍵 DEG，並在兩個東方甜瓜栽培品種果實之間進行了實時定量PCR （qRT-PCR） 表達分析在不同的發展階段。qRT-PCR 中所有選定基因的表達模式與 RNA-Seq 相似，平均r值為 0。9（r值從 0。73 到 1。00 不等），證實了 RNA-seq 資料的可靠性和後續分析（圖 7）。

圖7 | 12 個選定的與可溶性糖和有機酸代謝相關的 DEG 的 qRT-PCR 驗證

研究結論

含糖量和有機酸積累是甜瓜果實品質和口感的重要標準。因此，揭示甜瓜果實糖分積累和有機酸代謝的分子機制具有重要意義。本研究在不同成熟期果實中共檢測到961個DAMs，同時還檢測到14，703個DEGs。因此，本研究鑑定出的豐富代謝物和DEGs，不僅將為香瓜的高質量遺傳改良提供大量資訊，而且為葫蘆科其他作物提供有價值的參考。

在甜瓜中，蔗糖、葡萄糖和果糖的積累是決定果實品質的主要因素。在本研究中，蔗糖和D-葡萄糖含量明顯增加，並在AFS3達到峰值。有機酸在水果營養中起著至關重要的作用，其含量取決於酸合成和降解之間的平衡。中等濃度的有機酸可以增強水果的味道，但高濃度的有機酸往往會降低水果的質量。作者在A和B果實中都檢測到了檸檬酸和蘋果酸，檸檬酸首先升高在 AFS2 中，然後在 AFS3 中下降，但其含量隨著 B 果實成熟而持續增加。這反映了檸檬酸在 B 果實發育中的優勢，並可能解釋了 A 和 B 果實之間酸的差異。綜上所述，豐富多樣的糖類和有機酸導致了兩個甜瓜品種A和B的不同口味。

兩種東方甜瓜品種果實的基因調控改變糖代謝明顯不同。兩種甜瓜品種果實丙酮酸代謝與三羧酸迴圈的差異同樣顯著。根據作者的結果，PEPCK-2的表達上調並在 AFS2 達到峰值；同時，它在 B 果實成熟過程中持續增加，表明與 B 果實相比，A 果實中磷酸烯醇 - 丙酮酸的轉化發生得更早。這提供了一個線索，即丙酮酸代謝在 B 果實中可能比在 A 果實中更明顯。

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透過在三個成熟階段收穫兩個東方甜瓜品種的果實作者使用

非靶代謝組學聯合轉錄組學

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在本研究中，透過

代謝和轉錄組分析

的綜合分析，研究了控制兩個東方甜瓜品種‘甜寶’和‘小翠瓜’中糖和有機酸代謝的基因網路。篩選了與糖和有機酸代謝相關的關鍵代謝物和候選基因，並討論了甜瓜品種甜度不同的可能解釋。研究結果提高了對決定甜瓜發育和成熟過程中糖和有機酸積累和代謝的分子機制的理解。

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END本文系鹿明生物原創