#小普課堂四十#|蛋白質純化技巧

蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術。一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個複製。為了研究某一個蛋白質，必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。

蛋白質分離純化的一般程式可分為以下幾個步驟：

材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1、機械破碎法這種方法是利用機械力的剪下作用，使細胞破碎。常用裝置有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2、滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3、反覆凍融法生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4、超聲波法使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5、酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

　蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩衝液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩衝液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲製備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩衝液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1、等電點沉澱法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2、鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可透過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3、有機溶劑沉澱法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

　蛋白質的分析測定

透過物理或化學方法對蛋白質含量進行測定。蛋白質的分析純化，不僅僅是選擇合適的方法，必備的工具也很重要。