IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清？可能是目前為止最詳盡討論文章
ec50值怎麼計算
2017。10。7有更新，見文末（關於文中筆者自己提出的問題）
2017。10。24有更新，在Cheng-Prusoff方程部分，基於評論區知友
@被遺棄的鯨魚
提問更新，已用粗體標出
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前言
一直計劃在專欄裡討論一些藥物化學中常見的話題，然而筆者懶癌症發作，一直沒能下筆。最近剛好遇到動力學方面的一些問題，又回想起一直忘了回答的專欄文章
《藥物設計中的鄰位修飾策略》
評論區中的提問（by知友@
Yongle Li
），這裡結合筆者做的一些調研，總結一下題目當中的幾個常見定量引數，以期拋磚引玉。如有錯誤，歡迎指正。由於本文編輯自word，公式無法相容知乎文字編輯器，所以後文涉及到的公式都是截圖後插入的，涉及到常數K的後面的字母數字都應為下標，排版有點亂望諒解。
正文
在酶學水平上對小分子抑制劑進行生物活性的定量測定相信是很多藥物化學、化學生物學和生物學專業的同行們經常會遇到的問題。這個問題說難其實也不難，實驗操作一般很簡單，得到結果很容易；然而說簡單也不盡然，比如很多人未必對於題目當中列出的IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff等概念都分得清，實驗背後涉及到的米氏方程適用範圍究竟有多大？生化酶活實驗得到的抑制常數和基於生物物理手段（如ITC、SPR等）得到的抑制常數究竟有何區別，能否等價？我們常用的引數IC50真的能很好的反映出抑制劑的實際抑制強度嗎？小分子和蛋白的結合動力學與熱力學的聯絡及其在藥化中的作用？接下來我們就先從這些常見引數的定義說起，然後討論一下一些容易混淆的引數之間的區別。注：非特別註明，本文涉及到抑制劑時只討論常見的競爭性抑制劑。
在解釋之前先放一張酶學反應式的圖，方便後文的說明：
注：E=enzyme； S=substrate；ES=transition state complex of E and S； P=product； I，I’=inhibitor；EI，EI’=complex of enzyme and inhibitor； kx=corresponding reaction
rate constant； ［X］=concentration of X
一、 定義
1） IC50（half maximal inhibitory concentration）
EC50（half maximal effective concentration）
廣義的講，IC50是對指定的生物過程（或該過程中的某個組分比如酶、受體、細胞等）抑制一半時所需的藥物或者抑制劑的濃度。藥學中用於表徵拮抗劑（antagonist）在體外實驗（
in vitro
）中的拮抗能力。EC50是指在特定暴露時間後，能達到50%最大生物效應對應的藥物、抗體或者毒素等的濃度。藥學中除了用於表徵體外實驗中（
in vitro
）激動劑（agonist）的啟用能力外，還可用於表示達到體內（
in vivo
）最大生物效應一半時所需的血藥濃度。在很多文獻中，EC50也用於表徵某化合物在細胞水平的效力（包括激動和拮抗）
2） Ki
抑制常數（inhibition constant），反映的是抑制劑對靶標的抑制強度，這個值越小說明抑制能力越強，
某些情況下
可以與後文的Kd等同。
Ki為50%的酶E被抑制劑I結合時對應的遊離抑制劑的濃度。
3） Kd
解離常數（dissociation constant），反映的是化合物對靶標的親和力大小，值越小親和力越強。
從此公式得出：Kd為50%的酶E被抑制劑I’結合時對應的遊離抑制劑的濃度。
4） Ka
結合常數（association constant），與Kd相反，值越大親和力越強。
5） Km
米氏常數（Michaelis-Menten constant），為酶本身的一種特徵引數，其物理意義為當酶促反應達到最大反應速度一半時底物S的濃度。Km的大小隻與酶的性質有關，而與酶的濃度無關，但是隨著測定的底物不同、溫度、離子強度和pH的不同而不同。
只有當k2>>k3時，Km才近似等於ES的解離常數（Kd）。【注：王鏡巖第三版的《生物化學》上對競爭性抑制劑、反競爭性抑制劑的雙倒數方程推導時（P370、P372）都預設Km=ES的解離常數，這種假設是否合理，正在求證中，如果有知道的知友歡迎評論區中指出，萬謝！2017。10。07更新：此疑問已解決，見文末的解釋】
6） Kon
結合速率常數（association rate constant），代表分子間結合時的快慢，單位為M-1∙S-1，與結合常數Ka （association constant）一詞之差，差別卻很大。
7） Koff
解離速率常數（dissociation rate constant），代表分子間解離時的快慢，單位為S-1，與解離常數Kd （dissociation constant）一詞之差，差別卻很大。【注：在SPR實驗中，Kon和Koff 通常是以Ka和Kd給出的，而算出來的Kd和Ka它們又通常用KD和KA表示，注意這只是它們軟體自己的標註方法，千萬不要與標準的定義搞混了。個人覺得正是它們這種隨便自己命名常數表示形式的做法，才導致很多小夥伴們看到這些概念時越來越混淆，害人不淺】
——以上定義部分來自參考資料［1-2］
二、 區別
1） IC50和EC50
前面的定義部分其實已經說的很明白了，這裡簡單總結下使用範圍：
IC50：只表徵體外（
in vitro
）實驗中拮抗劑（antagonist）的效力，但一般不包括細胞水平的資料表徵。
EC50：可表示體外（
in vitro
）或體內（
in vivo
）資料：體外資料一般是細胞水平激動或者拮抗表徵，以及激動劑的酶學水平資料表徵；體內資料一般是動物水平。
2） IC50和Ki
從定義上能很明顯地看出兩者的區別，雖然兩者都是表徵化合物對靶標親和力的指標，但是IC50與實驗中所用酶的濃度、底物濃度都有關，而Ki是不受這些變數的影響的。目前很多藥物化學文獻中都不標註自己酶活實驗所用酶和底物的濃度，直接給出IC50資料，其實這不利於不同文獻之間化合物抑制能力的比較，因為IC50大小是可以透過酶和底物濃度進行調節的。從這個角度上來說，Ki才是更加準確的衡量指標，但是為何大多數文獻都不用呢？這主要是由於Ki的測定過程稍繁瑣。我們知道IC50的測定只需要拉出抑制劑濃度梯度進行生長曲線擬合即可方便地得出。然而Ki的測定需要先測定該酶特定條件下的Km，然後在某種抑制劑濃度、不同底物濃度下進行雙倒數作圖，得到表觀Km（即Kmapp）後再根據Kmapp=Km（1+［I］/Ki）得到Ki，不過在競爭性抑制劑情況下，固定酶的濃度，IC50與Ki滿足Cheng-Prusoff方程［3］（
注：此方程不適用於tight-binding型抑制劑，對於這種抑制劑其IC50與酶濃度相關
）：
也需要預先知道酶的Km值。
3） Ki和Kd、Km
先說Ki和Kd：9
前面提到過Ki和Kd在某些情況下是等同的。使用範圍上：除了一些激動劑我們不用Ki表示其親和力外（一般用Kd），拮抗劑用Ki和Kd表示其對靶標的親和力均可。但是隻有當無其他物質與該抑制劑進行競爭性結合時我們才能將Ki與Kd劃等號。很容易發現，我們前面提到過的Ki都是在有底物S存在條件下進行競爭性生化實驗測得的，而Kd都是單獨的抑制劑與靶標蛋白結合過程測定的，兩者的表示式都是：
可見唯一不同的就是Ki測定時多了底物的競爭，而根據Ki定義，總酶量一定時，若想達到50%的酶E被抑制劑I結合，必定比無底物S競爭時需要的總抑制劑I更多，那麼遊離抑制劑濃度也必然升高了，意即Ki升高了。不知大家讀到這裡有沒有聯想到什麼？這是不是跟表觀Km（Kmapp）定義幾乎一樣？沒錯，這就是抑制劑I在底物S存在下的表觀Ki［4］（類比於抑制劑存在時酶的Km就變成了表觀Km，即Kmapp），所以true Ki其實是在無其他物質競爭性與靶標結合時該化合物對靶標的親和力，即Kd，只有這時候我們才將Ki與Kd劃等號。在我們的實際實驗中，Ki一般是透過競爭性酶活實驗確定的，而Kd一般是透過生物物理的手段（比如ITC、SPR等）確定的，這時候顯然生化實驗中測得的表觀Ki（Kiapp）是無法與生物物理手段測得的實際Ki（或稱Kd）進行等價的。
最後，加入Km進行討論：
前面提到過Km與Kd也只能在特定條件下（即k2>>k3時）等價，而如何確定何時k2>>k3，這個筆者也在求證中，正如第一部分註釋中提到的疑惑，或許競爭性抑制劑和反競爭性抑制劑條件下都是k2>>k3，但這難免有強行解釋之嫌，未觸及到這個問題的本質原因，歡迎大家在評論區一同探討。【此問題已解決，見文末】
總結：true Ki/Km都是在無其他物質競爭性抑制條件下才能得到，有其他物質競爭性參與了則得到apparent Ki/Km值，我們可以將Kd視為true Ki，而Ki預設為 apparent Ki
三、 一點討論
分子結合動力學和熱力學在藥學中的作用
前面提到的這麼多動力學引數，對於我們定量比較不同抑制劑的抑制能力發揮著很大的作用，下面淺談一下動力學和熱力學的聯絡，以及其在藥物發現中的作用。
我們知道，計算自由能可由吉布斯自由能公式獲得：
ΔG=ΔH-TΔS
化合物和靶標結合前後變化的自由能為：
ΔΔG=RT·ln（Kd）=2。303RT·log（Kd）
按照這個公式計算，我們常見到的mM到pM級別的抑制劑，在37度條件下相應的結合自由能應該在-10到-70kJ/mol之間［4］。由前面的討論可知此處的Kd為無競爭性物質存在下的true Ki，由於一般情況下我們測得的IC50都存在底物S的競爭，因此由此得到的Ki值其實為表觀Ki（Kiapp），所以並不能直接將IC50與自由能掛鉤，只能透過生物物理方法得到的Kd進行計算得到相應的結合自由能。（此處@
Yongle Li
）
傳統上，藥化中評價一個化合物是否值得進一步推進，依據的重要指標就是IC50或Ki，而Ki越小則對應的結合自由能便更小，結合能力越強，可見不論是從動力學上看還是從熱力學上看，反映的都是結合的結果——即tight binding，可是tight binding卻並不見得一定與
in vivo
efficacy正相關：
上圖來自Robert A。 Copeland的一篇發於nature review drug discovery的文章，圖a顯示五個fabl enoyl-reductase 抑制劑
in vivo
活性與Ki的關係，可見並無相關性；而圖b分別測得五個抑制劑的drug-target residence time後發現與其survival rate呈現很好的相關性。而這個drug-target residence time其實就與前面提到的koff相關：t=1/koff ，可見單獨考慮Kd是不夠的，藥物靶標的結合過程也是需要重視的因素。舉例來說，兩個化合物Kd1=100/10=10nM，Kd2=20/1=20nM，若單從Kd上看化合物1可能更適合進行進一步體內生物活性評價，但是若同時考慮到滯留時間t的話，兩者親和力上只差了2倍，但是滯留時間t上化合物2卻是1的五倍，這種情況下是否化合物2是更好的選擇呢？
關於drug-target residence time其實還有更深入的話題可以分析，不過今天筆者只是借這篇文章的話題搭個便車，簡單提出了一下這個話題，希望能帶來一些思考和啟發，具體的就暫時不展開了，有興趣的讀者可以查閱文末參考文獻進行深入學習。
參考資料：
1。 wikipedia：
https：//www。
wikipedia。org/
2。 王鏡巖等，《生物化學》上冊，高等教育出版社，第九章
3。 Cheng Y， Prusoff WH Biochem Pharmacol。
22
（23）： 3099–108
4。 Gisbert Schneider，Karl-Heinz Baringhaus 《Molecular Design—concepts and applications》，WILEY-VCH， Chapter 2
5。 關於drug-target residence time的參考文獻：
1） Copeland， R。 A。； Pompliano， D。 L。； Meek， T。 D。 Nat。 Rev。 Drug Discovery 2006， 5， 730 −739。（概念首次提出）
2） Tummino， P。 J。； Copeland， R。 A。 Biochemistry 2008， 47，5481 −5492。
3） Copeland， R。 A。 Nat。 Rev。 Drug Discovery 2016， 15， 87 −95。
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2017。10。07
關於文中提到的王鏡巖版本《生物化學》中將Km視為ES的解離常數一事，後經過諮詢一個酶學方面的院士已得到解決：
事實上，在推導競爭性抑制劑的雙倒數方程時我們會用到兩種假說的一種：快速平衡假說或者穩態假說。快速平衡假說認為E與S快速達到平衡，而酶催化底物變成產物的速度在測定初速度那段時間可以忽略不計，等價於k2>>k3（目前學界認為這個假說其實是錯誤的，不符合大多數酶高效率催化的事實），這樣書中的推導結果是對的；穩態假說認為體系能快速達到一種平衡，即複合物ES濃度維持不變，換句話說就是ES消耗的速率和ES生成的速率相等，而酶的高效催化特性使得一般我們可以忽略k4，這時就有k1•［E］•［S］=k2•［ES］+k3•［ES］，就有Km=（k2+k3）/k1=［E］•［S］/［ES］=ES的解離常數，最後得到的結果也是一樣的。
覺得好神奇，不同的假說（其中一個還被證實為錯誤的）竟然都能得到正確的結果。
還有，假說拯救science，壯哉！
附上郵件截圖
