一文解讀：質粒載體及各個組成元件
一、什麼是載體？
1、把一個目的基因透過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），主要目的是分離、純化及表達特定的基因，此過程中需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（Vector）。
2、基因工程上所用的載體是一類能自我複製的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其複製功能，可用以置換或插入外源（目的）DNA而將目的DNA帶入受體細胞進行表達，主要包括質粒、噬菌體、病毒等。
二、載體的分類
1、載體按屬性可以分為：
（1）病毒載體，常見的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞；
（2）非病毒載體，一般是指質粒DNA；
2、按進入受體細胞的型別可以分為：
（1）原核載體
（2）真核載體
（3）穿梭載體（含原核和真核2個複製子，能在原核和真核細胞中複製，並可以在真核細胞中有效表達）。
3、如果按功能分類，可以分為：
（1）克隆載體：具有克隆載體的基本元件（Ori，Ampr，MCS 等），可以攜帶DNA 片段或外源基因進入受體細胞並克隆和大量擴增DNA 片段（外源基因）的載體；
（2）表達載體：這種載體中加入一些與表達調控（具有轉錄/翻譯所必需的DNA 序列）有關的元件即成為表達載體。
4、按性質分：
（1）融合型載體
（2）非融合型載體
常見載體的種類和特徵
三、什麼是質粒？具有哪些特徵？
1、質粒的定義
質粒通常被定義為圓形的、雙鏈的染色體外DNA。我們知道，每個細胞都有一個細胞核或核區域，包含了細胞的所有遺傳物質。但原核細胞和部分真核細胞，擁有額外的DNA，能獨立於細胞染色體而自主複製、並被穩定遺傳的一類核酸分子。這個額外的DNA被稱為質粒。它是雙股的，通常是圓形的，這意味著它連線在一起形成一個圓。
天然DNA質粒大都具有共價、封閉、環狀的分子結構，其分子量範圍：1-300 kb。
一個細菌的DNA和質粒
2、質粒的基本特徵
質粒的自主複製性（可擴增性）：
質粒能利用寄主細胞的DNA複製系統進行自主複製，並根據在每個細胞中的分子數（複製數）多寡，質粒可分為兩大複製型別：嚴緊型複製控制的質粒1~3複製；鬆弛型複製控制的質粒 10~60複製，不過即使是同一質粒，其複製數在不同的寄主細胞間和不同的生長環境也可能有很大的變化。
質粒的不相容性：
任何兩種含有相似複製子結構的不同質粒，不能同時存在於一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群。以大腸桿菌的質粒為例：
ColE1、pMB1 擁有相似的複製子結構，彼此不相容。
pSC101、F、RP4 擁有相似的複製子結構，彼此不相容。
p15A及其衍生質粒擁有相似的複製子結構，彼此不相容。
質粒的可轉移性：
革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：
接合型質粒——能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等。
非接合型質粒——不能在天然條件下獨立地發生接合作用如Col、R的其它成員。
攜帶特殊的遺傳標記：
野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：
物質抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物等。
物質合成：抗生素、細菌毒素、有機鹼等。
這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。
3、為何質粒成為廣泛應用的生物學工具？
（1）質粒不僅僅是修飾細菌和酵母等生物，質粒也可以在正常的細胞分裂過程中隨細胞一起復制，也可以自行復制。
（2）易於分離：很容易從宿主細胞中分離出來。
（3）質粒上可以進行特殊標記，十分利於篩選和鑑別。
（4）質粒存在重組DNA所需的某些區域，如複製起點（origin of replication）。
（5）質粒在尺寸上相比於基因組是很小的，它們相對來說更加易於研究和改造。
四、如何閱讀一個完整的質粒圖譜？
首先看質粒圖譜包含的4大要素：
1、
複製起點(ori)：
控制著質粒的複製，並決定了質粒的宿主屬性和複製數；
2、
篩選標記：
多為抗性基因，以便加以檢測篩選（包括原核抗性、真核抗性）；
3、
多克隆位點區：
外源基因的插入位點；
4、
其他元件：
如轉錄調控元件、翻譯表達元件和蛋白標籤等。
pcDNA3。1圖譜：1：複製起點；2：篩選標記（抗性基因）；3：多克隆位點區。
1、複製起點（Ori/origin）
圖譜中的
ori
表示質粒的複製起點，ori及其控制的組分一起稱為一個複製子。質粒的複製起點決定了質粒的宿主及質粒的複製數，
具有相同ori的質粒不可共轉染（質粒的不相容性）
。
若圖譜上只有一個ori，表示質粒是原核克隆及表達質粒（例如T載體）。
若圖譜上有兩個ori，則表示該質粒是穿梭質粒，既可以在原核也可以在真核中複製。
Ori複製子
：遺傳資訊傳給後代的首要條件就是它至少要具有一個複製原（ori， origin of replication）， 使整個基因體得以複製。含有複製原的遺傳物質稱為 replicon，複製子。
原核載體（T載體）：僅有一個Ori
真核載體（pcDNA3。1）：有兩個Ori
2、篩選標記
圖譜中的AmpR、KanR等表示質粒載體中的篩選標籤，多為抗生素抗性基因，方便後續透過抗生素篩選陽性克隆。只存在單抗性的質粒多為原核克隆載體和原核表達載體（例如T載體） 。而存在兩種或以上的抗性的多為穿梭質粒（如pcDNA3。1）。
原核載體（T載體）：僅含有單抗性（Amp+）
真核載體（pcDNA3。1）：含有多抗性（Amp+，Kan+）
3、多克隆位點區（Multiple Cloning Site，MCS）
是一段用於插入外源DNA片段的特定區域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成，而且每個限制性內切酶位點在整個載體中是唯一的。一般可透過酶切後連線的方式將外源DNA插入質粒。多克隆位點一般位於轉錄啟動和轉錄終止訊號之間。
多克隆位點區
4、其他調控元件
質粒載體中除複製起始位點、篩選標記、多克隆位點外，還具有其他一些表達或調控元件，如轉錄調控和翻譯調控元件和融合表達標籤蛋白等。
五、特殊元件或特殊序列
1、啟動子
啟動子通常分為三類：
組成型/廣譜啟動子，組織/細胞基因特異性啟動子，誘導表達啟動子
。
（1）組成型/廣譜啟動子：
組成型啟動子是在組成型啟動子的調控下，不同組織器官和發育階段的基因表達沒有明顯差異。組成型啟動子的調控不受外界條件的影響，所啟動基因的表達具有持續性，但不表現時空特異性，亦稱之為非特異性表達啟動子。常見組成型啟動子如下：
（2）組織/細胞基因特異性啟動子：
亦稱之為
器官特異性啟動子
，是指在該啟動子調控下，外源基因的表達一般只發生在某些特定的器官或組織部位，並往往表現出發育調節的特性。其最大的優點是它所啟動的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達，從而克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體中非特異、持續、高效表達所造成的浪費，增加轉基因的效果。特別在腺相關病毒載體中，特異性啟動子應用尤為廣泛。
常見的組織/細胞基因特異性啟動子
（3）誘導表達啟動子：
指在某些特定的物理或化學訊號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平，常見是四環素誘導表達啟動子，一些代表載體為GV308 TetIIP-MCS-3FLAG-Ubi-TetR-IRES-Puromycin （過表達慢病毒載體）和GV307 TetIIP-TurboRFP-MCS（MIR30）-Ubi-TetR-IRES-Puromycin （干擾慢病毒載體）對於某些特定的有毒基因，使用誘導表達啟動子載體是一個可行的解決方案。
2、標籤序列
標籤
，通常是相對較小的氨基酸序列。如果研究的是未鑑定的蛋白，或者尚未開發出優質抗體的蛋白（僅僅是因為研究的蛋白具有可商購的抗體，那並不意味著它是優質的），那麼第一步就是檢測，免疫沉澱或將親和標籤融合到蛋白上再純化蛋白。標籤選擇建議：
（1）如果是編碼基因，可以考慮增加一個標籤，有利於後續的檢測；
（2）有些標籤多串聯幾個，比如3*FLAG，3*HA等，可以增加檢測的靈敏度；
（3）標籤的位置，理論上標籤可以放在目的基因的5’端和3’端，通常預設放在基因的3’端，但是具體需要根據目的基因的功能考慮，比如目的基因是否有訊號肽，目的基因的C端後期是否會被切除等，這些因素都會決定標籤的位置。
（4）有些標籤較大，舉例GST標籤，可以考慮增加蛋白酶比如Thrombin，增加到GST與目的基因之間，後期可以很方便的將GST標籤切除。
常用標籤序列及功能介紹
3、Kozak序列
它是位於真核生物mRNA 5’端帽子結構後面的一段核酸序列，通常是
GCCACCAUGG
，它可以與翻譯起始因子結合而介導含有5’帽子結構的mRNA翻譯起始。對應於原核生物的SD序列。存在於真核生物mRNA的一段序列，其在翻譯的起始中有重要作用。
所謂Kozak規則，即第一個AUG側翼序列的鹼基分佈所滿足的統計規律，若將第一個AUG中的鹼基A，U，G分別標為1，2，3位，則Kozak規則可描述如下：
（1）第4位的偏好鹼基為G；
（2）AUG的5’端約15bp範圍的側翼序列內不含鹼基T；
（3）在-3，-6和-9位置，G是偏好鹼基；
（4）除-3，-6和-9位，在整個側翼序列區，C是偏好鹼基。 Kozak規則是基於已知資料的統計結果，不見得必須全部滿足，一般來說，滿足前兩項即可。
真核引物設計需在AUG前加上GCCACC。
4、poly(A) tail
poly(A) tail
：真核生物mRNA的3’端都存在的一段序列，可以起到穩定mRNA的作用：
（1）這種尾巴不由基因編碼，而是在轉錄後加到mRNA上的。加尾過程受位於終止密碼3’端的加尾訊號序列所控制。
（2）在結構基因的最後一個外顯子中有一個保守的AATAAA序列，此位點下游有一段GT豐富區或T豐富區，這兩部分序列共同構成poly（A）加尾訊號。
（3）哺乳動物細胞表達質粒主要是用於轉錄出mRNA，常用的轉錄終止子有SV40，hGH，BGH和rbGlob，同時包含有AAUAAA基序促進聚腺苷酸化和轉錄終止。除了上面列出的，SV40 late polyA 和rbGlob polyA被認為可以更加有效的終止轉錄。
有一點特別需要注意的是，哺乳動物細胞的poly（A）訊號和病毒包裝系統的聯合使用可能會降低病毒滴度，延長轉錄本的壽命，所以處理的時候需要謹慎一點。因為這個原因，病毒載體通常會使用其他非poly（A）的轉錄本穩定元件和出核元件，如
WPRE和CTE
或者使用其他弱的poly（A）訊號，如
BGH
。
5、WPRE序列
WPRE是一段順式作用的RNA元件，為轉錄後調控序列，放在多聚腺苷酸化訊號之前可顯著增加mRNA的表達水平和翻譯效率，進而增強基因的表達，並且WPRE插入病毒載體中還可以大大提升病毒包裝的滴度。而且
一般雙啟動，都是在後面一個加WPRE元件
。
事實上，每個基因轉錄確實需要一個poly A來結尾提高mRNA的穩定性，但慢病毒由於中間不可以有poly A，否則轉錄就會被提前中斷，因此確實也犧牲了一部分RNA的穩定性，甚至有時還會造成兩個啟動子的相互干擾。
6、IRES序列
IRES元件非常有用，通常在雙順反子載體中應用最多。核糖體在遇到下一個基因之前會離開mRNA，因為在一個基因翻譯結束之後，核糖體就會遇到終止子，然後從mRNA上脫離。在遇到IRES後，可以再重新結合到mRNA上進行翻譯。起到良好的“再啟動”作用。但是其缺點是元件非常大（500-600 bp），可能會在包裝能力有限的病毒轉移載體中佔據寶貴的空間。
六、完整觀察一個質粒圖譜
pUC
ori：
複製起始點，pUC為高複製表達質粒（120-200個/細胞）。
PBS：
引物結合位點。
RRE：
與REV蛋白結合，將未剪下的載體轉錄產物從胞核轉運至胞漿，提高病毒顆粒產生效率。
cPPT/CTS：
中央多聚嘌呤區，使病毒載體不受細胞分裂控制，允許廣泛細胞型別的有效轉導。
U6 promoter：
U6啟動子，真核啟動子，啟動shRNA的表達。
CMV：
真核啟動子，啟動ZsGreen1的表達。
ZsGreen1：
第三代綠色熒光蛋白，亮度最高的熒光蛋白。
PGK：
真核啟動子，啟動Puro的表達。
Puro：
嘌呤黴素抗性基因，真核抗性，用於質粒或病毒進入細胞後的篩選。
Amp：
氨苄抗性基因，原核抗性，用於質粒抽提時的篩選。
WPRE：
轉錄後調控序列，增加外源片段的表達效率。
3’LTR、5'LTR：
逆轉錄病毒基因組兩端各有一個長末端重複序列（5‘-LTR和3’-LTR），不編碼蛋白質，含有啟動子，增強子等調控元件。
七、如何改造一個質粒？
天然存在的野生型質粒由於分子量大、複製數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。需滿足以下改造原則：
（1）
一般載體越小，轉化的效率越高
；小的載體外源DNA片段的裝載量更大。因此，要刪除天然質粒不必要的DNA區域，儘量減小質粒的相對分子質量。
（2）在質粒上
引入含有多種限制酶切割位點的多克隆位點
，以便外源基因的重組。一般還要刪除重複的限制酶切割位點，使環狀的質粒經限制酶處理後只在一處斷裂，從而保證外源基因的準確插入。
（3）
加入易於識別的選擇性標記
，如各種抗生素抗性基因，以便檢測重組質粒是否成功進入受體細胞。
（4）為了保證實驗的安全性，杜絕重組質粒擴散，汙染環境，
要滅活某些質粒的編碼基因
，如促進質粒在細菌間轉移的mob基因。為了提高質粒的複製數，還要滅活那些抑制質粒複製的基因。
（5）
在質粒中引入特定用途的輔助序列，以滿足更多的實驗要求
。例如，引入LacZ基因用於藍白斑篩選；引入用於檢測和分離表達產物的標籤編碼序列，如多聚組氨酸標籤、由8個氨基酸組成的Flag-tag標籤等。
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