科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個PCR程序，最後透過標準曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術的特異性和準確性，被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

一、常規PCR

利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈，然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5‘-3’）的方向合成相應的互補鏈，如此迴圈往復以達到DNA分子擴增的目的，常規PCR技術無法實現精確定量。

圖1 常規PCR技術原理

二、實時熒光定量PCR

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要採用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等型別。

1.

DNA結合染料法

原理

：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用於核算定量和基因表達驗證。

優缺點：

它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，並且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會與單鏈DNA結合，並且在遊離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

圖2 SYBY Green I染料法作用機制

2.

基於探針的化學法

原理：

應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑑別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點：

探針法的鑑別能力遠遠大於DNA結合染料法，因為它們只與目的產物結合，從不與引物二聚體或其他非特異產物結合，缺點是它的合成價格高。

探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連線在探針的5’末端，而淬滅基團則在3’末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光訊號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光訊號。

圖3 TaqMan探針熒光訊號產生機制

3.

淬滅染料引物法

原理：

採用熒游標記引物擴增，從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑑別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點：探針和目標片段的特異性結合產生熒光訊號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價格高

三、實時熒光PCR儀

實時熒光PCR系統包括熱迴圈儀，用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光資料和管理分析的計算機軟體，資料透過實時分析軟體以圖表的形式顯示。

圖4 實時熒光定量PCR儀

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