熒光定量PCR中常見的8種對照

對照的目的是對檢測的各個環節進行監控，因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。常規熒光定量PCR的流程是：樣品採集-運輸-樣品處理-核酸提取-反轉錄（RNA病毒）-擴增-結果讀取。下面看看各個環節都可以使用哪些對照：

1.陽性對照（Positive control，PC）和陰性對照（Negative control，NC）

陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，並且有明確的預期結果。

2.擴增對照

我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控取樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。

3.內標（Internal Control，IC）

內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工新增的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。

3.1內參基因

通常它們在各組織和細胞中的表達相對恆定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin（BETA-actin）、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。

內參基因的優點是與樣品中的靶基因經歷完全相同的處理程式，可以監控取樣，運輸，核酸提取和擴增的全部過程。缺點是不同物種，不同生理狀態下，不同組織中的內參基因存在一定的差異。如果樣品型別是口腔液，咽拭子等樣品，內參基因的量很低可能導致實驗不成立。如果檢測的是環境樣品則內參基因可能完全失效。

3.2人工內標

新增一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接新增在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控取樣，運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由於是人工新增到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4.核酸提取對照

可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5.反轉錄對照（RT control）

可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質，滅活RNA病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。

無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6.空白對照（Blank control）

6.1無模板空白對照(No template control, NTC)

NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩衝液，所以NC等同於NTC。其實兩者有不同的作用。

6.2儀器空白對照

NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒有被汙染。這裡的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光訊號。

6.3熒光染料對照

最常使用的是ROX染料，由於熒光定量PCR的熒光訊號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的訊號值來校準每孔的熒光訊號。

7.質控品（Quality control, QC）

上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設定中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質（Reference material ，RM）。由於標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8.定值參考品

醫學上的定量檢測試劑盒，需要配套定值參考品用於試劑盒的定量檢測使用。

對照的選擇

從上文可知沒有一種對照是完美的，在檢測中我們要根據自己的需求來進行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測時新增一個能對從提取到擴增環節進行監控的質控品或標準物質；每份檢測樣品中新增內標（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內標，如果樣品型別為相對固定的動物組織建議使用內參基因）；擴增陽性對照，擴增陰性對照，無模板對照和ROX對照。有條件的新增臨床陽性對照和臨床陰性對照，在懷疑提取環節或者反轉錄環節出現問題時使用核酸提取對照和反轉錄對照。不定期使用儀器空白對照。

陽性對照與汙染

不可否認的一個事實是陽性對照可以增加實驗室汙染的風險。這種汙染的來源一種是直接來源於擴增陽性對照的汙染。對於擴增陽性對照來說通常10000複製/微升（CT值約25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴增陽性對照設定在CT值20以下，比大部分陽性樣本都強。這麼高濃度的對照給實驗室帶來了巨大的汙染風險，原因可能僅僅是因為試劑廠家擔心其陽性對照不穩定，長時間存放陽性對照降解。另一種汙染來自於擴增產物的處理不當，或者實驗室的設計佈局不合理。

初篩和確診

對照與實驗目的的關係好像從來沒有人提及過。根據筆者多年在檢測實驗室的經驗，分享一點個人的心得，歡迎大家批評指正。

對於初篩實驗，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測系統達到最高檢測效率，因此要在不同環節新增陽性對照，確保每個環節的檢測效率最高。

對於確診實驗，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測系統不出現假陽性，因此要在不同環節新增陰性對照，減少非必須的陽性對照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機插入幾個陰性對照，確保實驗過程中沒有被汙染。

內容原創 : 原博士