細胞遺傳學實驗方法-透過淋巴細胞微核測定來判定核輻射的危害

淋巴細胞微核

測定是細胞遺傳學分析中常用的方法之一，透過微核率的高低可以有效判斷染色體畸變率與輻射損傷。 #核輻射的危害#

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一、淋巴細胞分離

分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細胞。將血液用磷酸鹽緩衝鹽水按 1：1 稀釋，並在 Ficoll-Paque 上分層，血液 + PBS： Ficoll 的比例保持為 4：3。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鐘。去除淋巴細胞層（血沉棕黃層）並在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次，每次 10 分鐘，然後用培養基 RPMI 1640 洗滌。用血細胞計數器計數細胞密度。

二、培養條件

巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加溼培養箱中於 37o 培養。通常，每個培養物由 2 毫升培養基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成。培養基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨醯胺、100 單位/ml 青黴素、100 ug/ml 鏈黴素和 1。5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。 在起始後 44 小時將微核測定細胞鬆弛素 B 加入到培養物中。細胞鬆弛素 B 阻止細胞完成胞質分裂，導致多核細胞的形成。細胞培養物中細胞鬆弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。 在培養開始後 72 小時，使用細胞離心機 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然後將細胞以 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風乾。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中，在 N2 下乾燥。

三、細胞染色與微核測定

染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0。1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多餘的液體，並用含有 0。2% Tween 20 的 PBS 1：1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20。然後將載玻片蓋上蓋玻片並置於 37oC 的加溼室中 1 小時。在含有 0。1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘後，再次排出多餘的液體，用 1：50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片並再次孵育 1 H。因為熒游標記的抗體暴露在光線下會褪色，此步驟和所有後續步驟應在黃燈下進行。將載玻片在加 0。1% Tween 20 的緩衝液中沖洗兩次，並在抗褪色溶液中用 4‘6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） （2 ug/ml） 復染。

細胞微核對於

淋巴細胞微核

測試，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經歷了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測，每個重複培養物中的 500 個細胞，用於計算微核的數量。透過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否。 檢測標準如下：

1） 細胞應具有完整的細胞質的圓形或橢圓形外觀

2） 細胞核應同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜

3） 只有經歷過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在

4） 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數

5） 微核的染色應與主核相似

6） 微核應與主核明顯分開

細胞染色 複製指數 （RI），細胞分裂動力學的量度，透過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1、2、3 或更多細胞核的細胞百分比，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測。複製指數RI 計算如下： RI = （1x% 單核細胞） + （2x% 雙核細胞） + （3x% tri） + （4x% 四核細胞）…… 更多振盪培養箱、生物反應器、移液器、離心機、顯微鏡等實驗室儀器裝置、試劑耗材及

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