默克生命科學乾貨分享：熒光壽命測量

簡介

熒光壽命（FLT）是熒光團在發射光子並返回基態之前花費在激發態的時間。根據熒光基團的不同，FLT可以從皮秒到數百納秒不等。

熒光團群的壽命是指經熒光或非輻射過程的能量損失後，激發態分子數量以指數方式衰減到原始數量的N / e（36。8％）的時間。

熒光壽命是熒光團的固有屬性。FLT不依賴於熒光團濃度、樣品吸收、樣品厚度、測量方法、熒光強度、光漂白和/或激發強度。它受外部因素影響，如溫度、極性和熒光淬滅劑的存在。熒光壽命對依賴於熒光團結構的內部因素敏感。

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確定熒光團熒光壽命的方法

熒光壽命可以在頻域或者時間域測量。

時間域測量方法涉及用短光脈衝照射樣品（比色皿、細胞或組織），然後隨時間測量發射強度。FLT由衰減曲線的斜率確定。有幾種熒光檢測方法可用於壽命測量，其中時間相關單光子計數（TCSPC）可實現簡單的資料收集和增強的定量光子計數。

頻域方法涉及高頻率入射光的正弦調製。在該方法中，發射發生在與入射光相同的頻率處，並且隨著激發光兼有相位延遲和振幅的變化（解調）

熒光壽命測量相對於基於強度測量的優勢

壽命測量不需要波長比率探針來提供眾多分析物的定量測定。

壽命法透過使用光譜位移探針擴充套件了分析物濃度範圍的靈敏度。

壽命測量可用於沒有直接探針的分析物。包括葡萄糖、抗原或基於熒光能量轉移轉導機制的任何親和力或免疫測定。

應用

熒光壽命分析：

熒光壽命是用於幾種生物測定的穩健引數。它有可能替代傳統的測量技術，如吸收法、冷光法或熒光強度法3。熒光團物理化學環境的任何變化都會導致熒光壽命的改變。可透過各種機制來研發基於壽命的分析，例如簡單的結合測定，涉及到兩個組分的結合（一個被熒游標記）而引起FLT的變化。另一種機制是猝滅釋放型測定，涉及大量過量存在的猝滅物質，其具有低而有限的熒光。一旦熒光化合物被釋放（透過酶促反應或與互補DNA結合），系統的壽命就會改變。FLT可與FRET（熒光共振能量轉移）分析結合用於能量轉移效率測量。

熒光壽命感測：

該技術基於探針壽命或衰減時間的變化。納秒（ns）的衰減時間可以透過相位調製來測量。該技術已被廣泛用於檢測pH、Ca2+、K +、葡萄糖和其他代謝物。透過使用具有在近紅外區域激發和發射光譜的光學探頭，基於壽命的感測方法在組織和其他隨機介質中的應用已有最新的發展。4，5

熒光壽命成像（FLI）：

這種技術相對較新，涉及到同時在影象的每個畫素處確定熒光衰減時間的空間分佈。它基於熒光團的熒光壽命取決於其分子環境而並非濃度的事實。它可以用於無法控制區域性探針濃度的熒光顯微鏡中。熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）可用於測量分子環境引數，透過熒光共振能量轉移（FRET）進行的蛋白質相互作用，並可以透過細胞和組織的自發熒光來測量其代謝狀態。分子環境引數可以透過因熒光淬滅或熒光團的構象變化而引起的壽命變化來測量。FLIM可用於多種生物應用，包括組織表面掃描、組織型別繪圖、光動力治療、DNA晶片分析、面板成像等6。

弱發射體具有較短的熒光壽命，而壽命較長的熒光團具有較低的光子週轉率。由於其有限的靈敏度以及曝光和採集時間較長的必要性，它們對於壽命成像並不是很有用。

下面列出了壽命成像中常用的不同型別的熒光分子和探針：