細胞治療專欄文章（四） | 基因編輯技術在細胞治療中的研究進展

李大力

， 博士， 華東師範大學生命科學學院研究員。近年來， 圍繞基因編輯技術開展了一系列的研究工作， 特別是在人類疾病動物模型構建以及基因治療方面開展了大量研究。利用TALEN和CRISPR/Cas等基因編輯技術在國際上率先建立了快速高效的大鼠和小鼠基因修飾技術體系， 實現了大鼠多基因同時敲除。透過基因編輯技術定點修復突變基因， 在小鼠模型中治癒了B型血友病， 為血友病的治療提供了長效解決方案。利用腺苷單鹼基編輯工具實現了在小鼠胚胎內的精確單鹼基突變， 併成功擴充了腺苷酸單鹼基基編輯工具的潛在靶向位點。證明了在脊椎動物中擴充遺傳密碼子的穩定性和可行性。發表SCI論文70餘篇， 近年來以通訊作者身份在

Nature Biotechnology

等雜誌上發表論文26篇， 其中申請基因編輯或基因治療專利12項。

http://www.biomed.ecnu.edu.cn/97/5c/c9348a104284/page.htm

注：

《中國細胞生物學報》2019年出版了“創刊四十週年專欄 • 基於細胞的治療——現狀及展望”專題文章，由中科院生化細胞所

惠利健

研究員擔任特約編委組織了系列綜述文章，經授權，BioArt從2019年10月6日起陸續轉載相關專題文章，希望讀者對細胞治療有更清晰的瞭解。

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基因編輯技術在細胞治療中的研究進展

作者：

李大力

華東師範大學

摘要

近年來，基因治療領域捷報頻傳，在遺傳疾病和腫瘤等疾病的治療方面多個基因和細胞治療藥物獲批上市， 更有一批新藥將在2~3年內上市， 為患者帶來革命性的治療方案。相對於傳統的外源基因匯入的基因治療策略而言， 基因編輯技術能實現基因組片段高效而精確的修復、插入和剔除，有望顯著提高基因治療的永續性和安全性。以鋅指核酸酶（zinc fingernuclease，

ZFNs

）、轉錄啟用因子樣效應核酸酶（transcription activator-likeeffector nuclease，

TALEN

）、規律成簇的間隔短迴文重複CRISPR/Cas核酸酶（clusteredregularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR- associated systems，

CRISPR/Cas

）為代表的基因編輯技術蓬勃發展為細胞治療領域帶來開創性突破。

該文將重點回顧基因編輯技術應用於細胞治療的不同策略, 探討其在細胞治療中的特點、應用前景、機遇和挑戰,以期為基因編輯技術向細胞治療的臨床轉化提供參考。

越來越多的研究發現， 絕大多數疾病的易感性都與DNA的變異相關， 其中最為典型的例子就是通常所說的遺傳疾病， 特別是單基因遺傳病。

在已知的6，000多種遺傳病中, 目前只有大約5%的疾病可以透過定期服用小分子藥物或酶替代療法進行治療, 超過95%的病種沒有有效的治療方案, 治癒更是無從談起[1]

。上世紀60年代提出了基因治療概念， 希望透過匯入治療性基因藥物來治癒由於基因缺陷而造成的疾病， 為遺傳疾病的治療帶來了希望， 特別是單基因突變造成的遺傳病（

https：//www。

ncbi。nlm。nih

。 gov/clinvar/）。

經典的基因治療主要有兩種策略: 在體

（in vivo）

基因治療

和

離體(

ex vivo）

細胞介導的基因治療

。前者是直接利用遞送載體（主要分為重組病毒載體和非病毒遞送載體）將基因藥物進行區域性注射或者靜脈注射匯入到靶器官進行表達而彌補缺陷基因的功能； 後者主要是將患者的細胞（一般是成體幹/祖細胞、以CAR-T細胞療法為代表的免疫細胞或者極具應用前景的iPS細胞）分離培養，同時進行基因操作以修復患者細胞的遺傳缺陷， 再透過自體回輸來進行治療。

N Engl J Med 2019； 381：455-464

透過數十年的努力， 基因治療在最近幾年獲得了突破性的進展。

截止到2018年, 全球己經開展了2，600多項基因治療的臨床研究,共有7個基因治療藥物分別在中國、美國和荷蘭等國家獲批: 4個用於腫瘤治療(2個溶瘤病毒: 英文名為Oncorine和 T-VEC; 2個CAR-T細胞療法: Kymriah和Yescarta)、 3個用於遺傳疾病治療(治療脂蛋白脂肪酶突變的Glybera, 治療腺苷脫氨酶突變造成重症聯合免疫缺陷的Strimvelis以及治療REP65基因突變造成先天性黑矇症的Luxtuma)。Strimvelis、Kymriah和Yes- carta這3個藥物都是透過離體細胞治療的方式分別將基因藥物整合到患者造血幹細胞和T細胞再自體回輸[2]

， 可見細胞介導的基因治療策略非常成功。

N Engl J Med 2019； 381：455-464

細胞治療相對於體內治療顯著的優勢在於可離體編輯靶細胞群， 用可程式設計核酸酶修飾後可將校正後的細胞移植回原始宿主中。這種治療模式可以利用多種基因藥物的遞送體系來對靶細胞進行基因操作， 例如電穿孔、陽離子脂質、細胞穿透肽和病毒載體

[3]

。這些匯入方式與直接匯入體內的在體療法相比具有更高的效率， 同時體外基因操作的幹細胞具有可培養和傳代擴增優勢，能進一步地富集所需的陽性細胞， 有效提高治療效率。許多離體治療可以控制所遞送的治療分子的特定劑量， 從而減少核酸酶的脫靶修飾

[4]

。離體細胞的純化、培養和移植等專業技術的長足發展也為細胞治療提供強有力的技術支援。

目前來說,獲批的幾個基因治療產品無一例外都是透過重組病毒作為遞送載體, 不可避免地出現兩個方面的擔憂:一是非整合型病毒表達基因藥物時效性不夠長而整合型病毒會將外源基因隨機插入到受體細胞的基因組中, 另一個是可能導致腫瘤的發生

。最理想的策略是將基因藥物精確整合到基因組的特定位點， 實現長時間穩定表達。由於腫瘤基因治療的特殊性以及本期有專文討論CAR-T 細胞療法的進展，本文主要圍繞基因編輯介導的離體細胞治療的研究進展進行回顧和展望。

1 基因編輯進展概述

近年來， 隨著多種人工核酸內切酶技術的出現， 高效的基因編輯技術得到了快速發展和廣泛應用。人工核酸內切酶技術主要包括四種： 大範圍核酸酶技術（meganuclease）、鋅指核酸酶技術（zincfinger nuclease，

ZFN

）、轉錄啟用因子樣效應物核酸酶技術（transcriptionactivator-like effector nuclease，

TALEN

） 和成簇的規律間隔的短迴文重複序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，

CRISPR

）/ CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated proteins，

Cas

）系統。

圖源：https：//www。the-scientist。com/lab-tools/jacking-up-gene-knock-ins-65504

透過人工核酸酶可以精確靶向雙鏈DNA產生雙鏈斷裂（doublestrand break，

DSB

）。DSB促使細胞啟動兩種主要的DNA損傷修復機制： 非同源末端連線（non-homologous end joining，

NHEJ

）

[5]

和同源重組 （homology-directed repair，

HDR

）

[6]

。NHEJ可以發生在細胞週期的任一時期， 是最主要的高效修復方式， 但是由於透過NHEJ精確修復（canonical non-homologous end joining，

C-NHEJ

）的DNA序列會再次被核酸酶切割， 所以最終會出現不同長度片段（主要是少 數幾個鹼基）的插入、刪除或替換（insertion/deletion/substitution，

indel

） ， 從而導致基因失活（alternative-non homologous end joining，

A-NHEJ

）

[7-8]

。HDR是 一種精確但低效的修復方式， 在有同源序列作為重組模板的前提下僅發生於細胞週期的S/G2期

[9]

。

基於CRISPR/Cas9技術， 將胞唔睫脫氨酶或者腺昔脫氨酶與Cas9缺口酶（Cas9-nickase，

Cas9n

）融合， 產生了單鹼基編輯（baseediting）技術。

單鹼基編輯技術直接利用脫氨酶將鹼基脫氨透過DNA複製精確引入鹼基替換, 最大的優勢是效率高, 不依賴於同源重組也極少引起indel, 有著更安全的特點, 具有非常大的應用潛力[10-13]

。與此同時， 隨著科學家對基因編輯工具認識的不斷加深和改造，基因編輯工具的應用領域也從基因組編輯發展到了表觀基因組編輯

[14-15]

和轉錄組調控領域

[16-19]

， 開發出一系列表觀基因組編輯工具和轉錄調控相關工具。這些工具展示了基因編輯技術的超強可塑性，增加了更多的應用場景， 也在基因治療中展現了無可比擬的優勢。

2 細胞治療中多種基因編輯策略的應用

經典的基因治療只能將外源基因新增到細胞中， 透過過表達基因產物達到治療的效果。基因編輯技術則更加靈活， 可以透過定點整合來修復突變基因或者過表達治療性基因產物， 可以刪除基因編碼區部分序列達到基因失活的效果， 還能作用於基因的啟動子序列來增強或者減弱基因表達。體內基因編輯治療的基礎研究進展較快， 例如透過同源重組在肝臟中原位修復致病突變， 治癒I型酪氨酸血癥 （hereditary tyrosinaemia type I，

HT-I

）

[20-21]

、B型血友病

[22]

和致命性高血氨症

[23]

； 透過在耳蝸毛細胞中敲 除TMC1致病性的雜合突變等位基因而保留正常的等位基因， 恢復模型小鼠聽力

[24]

； 透過基因編輯刪除 dystrophin基因中提前出現終止密碼子的外顯子區段， 在小鼠

[25-26]

和狗

[27]

中顯著改善杜氏肌營養不良症（Duchenne muscular dystrophy，

DMD

）的症狀。

然而， 在體基因治療也只能針對部分疾病， 對於體內病毒感染效率非常低的造血幹細胞等束手無策， 而且包括我們課題組在內的研究均發現即便是體內AAV感染效率最高的肝細胞， 在成年動物中透過同源重組修復單個鹼基突變的效率都低於5%， 通常只有2%以下。而離體細胞治療的方法可以高效感染造血幹細胞， 例如2018年4月，

The New England Journalof Medicine

雜誌上發表了一項關於β-地中海貧血症（β-thalassemia，簡稱

β地貧

） 治療的重要成果。

研究者從患者體內提取出CD34+造血幹細胞, 透過轉染LentiGlobin BB305慢病毒載體匯入可編碼成人血紅蛋白p-鏈的HbAT87Q基因, 再重新回輸到患者體內, 實現患者紅細胞中正常p珠蛋白的高表達, 這 項基於自體細胞的基因療法,最終減輕了患者的貧血症狀和輸血依賴。值得注意的是, 其減少輸血依賴的有效率達100%,並且在之後的隨訪中, 經治療的22例患者的長期輸血需求明顯減少, 或已完全不需要輸血,該療法並沒有帶來明顯的副作用[28]

。

離體細胞治療還可以在體外擴增或富集有效匯入的陽性幹細胞， 提高治療成功率。例如，2017年， Michele De Luca課題組

[29]

報道了透過自體移植轉基因表皮幹細胞， 在一個患有嚴重交界型大皰性表皮鬆解症（Junctional Epidermolysis Bullosa，

JEB

）的7歲兒童身上修復了80%左右的表皮。透過從病人中分離表皮幹/祖細胞， 將正常的LAMB3基因透過逆轉錄病毒匯入患者細胞， 形成穩定感染的克隆後在體外擴增形成類似於表皮的結構再進行自體移植。這些細胞形成上皮組織可永久性地恢復大量面板的缺陷。

這些透過逆轉錄病毒或慢病毒直接匯入外源基因的傳統基因療法在臨床上取得了巨大的成功，說明基於細胞的基因治療在很多疾病治療方面有著巨大優勢，

但是傳統方法採用的慢病毒匯入方式有著隨機整合的致瘤風險,因此需要新的策略實現高效精確整合

。下面將圍繞不同的基因編輯策略探討其在細胞治療中的應用及進展。

2.1 利用NHEJ的基因編輯治療思路

通常情況下， 由於NHEJ修復往往造成單個或多個鹼基的插入或缺失，常用於破壞正常的基因閱讀框， 使基因失活。利用這一策略最為成功的例子是人們可透過ZFN在T細胞中敲除HIV共受體之一的CCR5基因進行艾滋病的治療。在歐洲，有部分人 CCR5基因編碼區第185位氨基酸密碼子以後發生了32個鹼基缺失導致基因失活， 這些人對HIV-1病毒有天然的免疫力。2007年， Brown在德國一家醫院接受天然CCR5突變的造血幹細胞移植進行白血病治療， 同時他體內的HIV病毒也完全消失了， 成為世界上首例被“治癒”的艾滋病患者

[30]

。

受此鼓舞， 研究者在前期研究中分別在人CD4+ T細胞和造血幹/祖細胞利用ZFN破壞CCR5基因， 編輯效率分別為50%和 17%。將編輯後的細胞移植到免疫缺陷小鼠中， 用 HIV-1病毒攻擊可以進一步富集CCR5基因缺失的細胞， 證明了該療法的可行性

[31-32]

。在此基礎上， 研究者

將12名HIV-1感染者的T細胞分離出來, 利用ZFN 對CCR5的編碼區進行編輯,細胞體外擴增後, 每位患者一次性注入100億個T細胞(CCR5編輯效率為 11%~28%)

。隨機分組的6名患者在自體T細胞移植4 周後開始停止服用抗逆轉錄病毒藥物， 其中4名患者12周檢測時病毒數量顯著減少

[33]

。

該研究是第一個利用基因編輯進行疾病治療的臨床研究, 從概念上證明基因編輯用於基因治療的安全性和有效性, 具有劃時代的意義。

Trends Biotechnol。 2015；33（3）：172-9。

然而也可以看到ZFN的基因編輯效率比較低， 這主要是ZFN本身編輯活性有限， 另外 T細胞和造血幹細胞的基因遞送難度較大。該研究中所用的質粒DNA電轉和腺病毒遞送都不能達到很高的效率。最近Alexander Marson實驗室

[34]利用 CRISPR/Cas9在CD4+ T細胞中使CCR5的表達量下降了近80%, 並有效阻止了HIV-1病毒衣殼的感染

。

NHEJ除了可以用來破壞基因的編碼框， 也可以作用於啟動子、增強子等非編碼序列， 抑制或者啟用目的基因的表達， 達到治療的效果。β地貧是臨床上常見的遺傳性血液病之一， 其病因是β珠蛋白基因的突變， 導致本應與其結合形成成人血紅蛋白（adult hemoglobin，

HBA

）的α珠蛋白在紅細胞前體中不斷積累使紅細胞前體過早凋亡。

若能重新開啟人體中被沉默的γ珠蛋白(主要在胎兒期表達,出生後表達被沉默)表達則能夠使遊離的α珠蛋白與γ珠蛋白形成胎兒血紅蛋白(fetalhemoglobin, HBF), 達到治療p地貧的目的[35]

。BCL11A正是負責沉默γ珠蛋白的主要轉錄抑制因子， 由於BCL11A基因在造血幹細胞中有著關鍵作用， 不能直接敲除。

2015年哈佛醫學院 Dan E。 Bauer研究小組與麻省理工學院的張峰研究組

[36]

合作，利用CRISPR/Cas9技術在紅細胞前體細胞系HUDEP2中篩選得到了一個BCL11A的紅系特 異性增強子。和預期的一樣，在利用CRISPR/Cas9技術破壞該增強子後， BCL11A在紅細胞前體中的表達大大降低， 而γ珠蛋白的表達以及HBF的含量則大大提高， 造血幹細胞的正常紅系和多能分化功能並未受到影響。由於造血幹細胞的分離和移植技術己經很成熟， 在分離後的造血幹細胞中敲除BCL11A增強子， 隨後重新移植入患者體內就有可能治癒或緩解患者的病情。

而就在一年後來自St Jude兒童醫院的MitchellJ Weiss研究組

[38]

再次將治療β珠蛋白類突變疾病的理想向前推進了一步， 與Dan E。 Bauer研 究組不同的是，他們將CRISPR/Cas9的靶點直接指向了γ珠蛋白的啟動子 102一104區域。有研究表明， 該區域為BCL11A的結合位點，臨床上發現如果 該區域發生缺失同樣能夠導致γ珠蛋白升高即高胎兒血紅蛋白症（heterocellularhereditary persistence of fetal hemoglobin，

HPHF

）

[37]

。Weiss研究組

[38]

在鐮刀狀貧血（sickle cell disease，

SCD

， 該疾病同樣是β珠蛋白突變導致的）病人的造血幹祖細胞中針對102一104區域利用Cas9進行編輯後發現， 低氧誘導產生的病態鐮刀狀細胞比例由20%以上降低到了個位數比例。以上兩項研究對β地貧和鐮刀狀貧血的治療有著巨大的意義， 相關的臨床研究（ClinicalTrials。 govIdentifier：NCT03655678）也己經被開展。

利用基因編輯工具在相近的基因組區域產生兩個DSB。NHEJ修復過程中還可能將兩個DSB區間的DNA序列倒位後再連線起來,可以針對由於倒位而產生的遺傳疾病

。來自法國染色質和基因發育調控實驗室Annarita Miccio研究組

[39]

的研究表明， 在造血幹/祖細胞中， 利用CRISPR/Cas9敲除δ與β珠蛋白基因間13。6 Kb或使其倒位也可以重新啟用胎兒血紅蛋白的表達。類似地，來自韓國的Jin-Soo Kim 的研究小組

[40-41]

在兩篇報道中分別利用TALEN和 CRISPR/Cas9技術在iPS細胞中成功修復了140 Kb DNA和600 Kb倒位的A型血友病細胞模型， 這些修復後的iPS細胞在分化成內皮細胞並進行皮下移植後成功緩解了A型血友病模型小鼠的疾病症狀。

總的來說，雖然ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9理論上都適用於基於NHEJ的細胞治療， 但是CRIS- PR/Cas9系統僅需根據不同位點設計相應的sgRNA， 更加簡單靈活而高效，所以在CRISPR/Cas9技術出現以後越來越多的相關領域的研究開始轉向利用 CRISPR/Cas9系統。特別是對於需要產生多個DSB 的治療模型，利用CRISPR/Cas9技術只需遞送多個sgRNA，非常簡便。而反觀利用ZFN或者TALEN的方法都需要多遞送1對或多對核酸分子， 增加了遞送成本和難度， 也大大降低了同時編輯的效率。

2.2 利用HDR的基因編輯治療思路

在大多數由基因突變導致的疾病當中， 仍然需要透過精準的基因修復或者在安全位點（例如， AAVS1基因座）插入正常的基因才能夠實現基因治療， 此時利用DSB來提高HDR就變得意義重大。來自Sangamo公司的Wang等

[42]

透過電轉將ZFN-mRNA 遞送到HSPC後再利用AAV6病毒遞送供體模板，成功地將GFP基因分別插入到了CCR5 和AAVS1 位點中， 效率分別達到了17%和26%，而在胎肝來源的HSPC中效率更是高達19%和43%。而此前僅利用 IDLV（integrationdeficient lenti virus）作為供體的定點整合效率只有0。1%

[43]

。利用類似的手段， 來自 Sangamo公司的Kang研究組等

[44]

在慢性肉芽腫病人來源的HSPC中， 將治療性的

gp91phox

基因成功地特異性整合到AAVS1基因座，效率約為7。1%。NSG小鼠移植模型證明了長期再生性造血幹細胞和祖細胞 （long termrepopulating HSPC）的確得到了正確的基因插入，為治療人類血液和免疫系統疾病提供了新的思路

[44]

。

DeWitt等

[45]

則透過最佳化包含Cas9蛋白和 sgRNA的核糖核蛋白（RNP）複合物來遞送CRISPR-Cas9系統，利用單鏈DNA寡核昔酸（ssODN）作為供體修復SCD突變， 精確修復的效率高達33%， 經校正的HSPC產生了較少的鐮狀血紅蛋白RNA和蛋白質， 並且當分化成紅細胞時相應地增加了正常的血紅蛋 白表達。將經過編輯的人HSPC移植到NSG小鼠體內， HSPC中的基因編輯效果可以維持整整16周，具有非常好的臨床應用前景。基因整合效率與治療效果直接相關，如何進一步提高修復後細胞的比率一直是困擾研究者的問題。利用AAV6病毒作為供體， Porteus實驗室

[46]

透過電轉Cas9與sgRNA的RNP 複合物來切割基因組， 成功將帶有正常HBBcDNA以及tNGFR篩選標籤的供體片段插入了SCD患者造血幹細胞的HBB啟動子之後，效率達到了11%。儘管核酸酶產生的DSB己經將重組效率提高了3個數量級， 然而在Porteus的實驗中仍遠遠達不到直接用於治療的級別。為了富集基因定點整合的造血幹細胞，Porteus研究組

[46]

在插入目的基因的同時插入了 tNGFR胞外段標籤， 使得宮們可以透過微磁珠來富 集發生正確重組的細胞，經過富集後HBB的整合效率在tNGFRhigh細胞中約為86%。

為了提高重組效率， 研究人員也在不斷尋找 促進HDR的小分子藥物如SCR7、RS-1等

[47-48]

，抑 或嘗試新的供體設計如單鏈寡核苷酸（SSODN）

[49]

、 HMEJ供體

[50]

、硫代磷酸醋修飾供體

[51]

等， 不過還需 要更多的實驗資料來驗證這些藥物在臨床運用上的價值。

2.3 利用單鹼基編輯工具的治療思路

雖然HDR的靈活性和準確性高, 但是修復效率一直是其限制因素,使其在基因治療中的應用充滿了侷限性。迄今為止在已知的疾病資料庫中, 突變型別最多的還是單鹼基突變或稱單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)

。2016 年， 來自哈佛大學的Liu研究團隊

[10]

、中國科學院的常興課題組

[12]

以及日本神戶大學的Akihiko Kondo團隊

[13]

先後分別利用胞苷脫氨酶rAPOBEC1、hAID和 PmCDA1（來自七鰓鰻的AID）開發出了能夠將C/G鹼基對突變為T/A鹼基對的胞苷鹼基編輯工具（cytidine baseeditors，

CBE

）。一年後，Liu課題組

[11]

又利用 “噬菌體協助的持續進化（phage-assistedcontinuousevolution，

PACE

）”創造出了將A/T鹼基對突變為G/ C鹼基對的腺苷鹼基編輯工具（adeninebaseeditors，

ABE

）。總體來說， 兩類鹼基編輯工具的工作原理是將不同的DNA脫氨酶（rAPOBEC1、AID或tadA）融合在Cas9的N-端表達， 利用Cas9/sgRNA將脫氨酶靶向目標序列， 進而利用各自融合的脫氨酶實現鹼基的脫氨和轉變。

鹼基編輯工具的優勢在於編輯過程中不易發生大片段缺失、平均效率較HDR高， 為疾病的精確治療提供了新的思路。

其最直接的應用是原位修復導致疾病的突變

。2017年， Liang等

[52]

首次在人類的胚胎中實現了β珠蛋白基因（HBB）第28位A>G的 突變修復（HBB 28 A>G是導致地中海貧血的常見突變之一）， 在概念上實現了利用鹼基編輯工具治療遺傳疾病的目的。除此之外利用鹼基編輯工具可以更精確高效地透過對剪下供體和受體的突變調控mRNA的剪下。這一點有望用於一些特殊的遺傳疾病， 例如DMD

[53]

。2018年， 常興課題組

[54]

利用的 AID-saCas9透過外顯子跳躍技術恢復了DMD病人iPS細胞中DMD的轉錄本，從而恢復了DMD蛋白的功能。

然而，鹼基編輯工具的發展目前還處於起步階段， 仍然面臨著一些挑戰。例如，spyCas9蛋白過大導致單鹼基編輯工具的大小普遍在4。5 Kb以上， 增 加了AAV病毒的包裝難度， 甚至使其無法包裝； 該工作位點受到NGG PAM的限制；

編輯視窗較寬,容易造成“旁觀者突變

（Bystandermutation）”。為此研究人員包括本課題組

[55-56]

開發出了基於Cpf1、saCas9等較小CRISPR系統的單鹼基編輯工具， 同時也在嘗試改變spyCas9的PAM識別序列

[57]

。而為了解決旁觀者效應，哈佛大學的Gehrke等

[58]

透過在A3A-BE3 上引入新的突變， 創造了新的eA3A-BE3單鹼基編輯工具。eA3A-BE3更傾向於突變TCR（R為嘌呤）序列中的胞嘧啶， 且保留了較高的編輯效率。他們透過將eA3A-BE3的重組蛋白與化學合成的sgRNA複合物電轉到β地貧患者造血幹細胞中， 精確地修復了HBB基因啟動子上的單鹼基突變而幾乎不引起其他位點的胞嘧啶的轉換。這個新的單鹼基編輯工具解決了在基因治療中單鹼基編輯酶突變視窗過大可能引起周圍其他位點同時突變的副作用， 另外利用RNP的形式遞送單鹼基編輯工具也有效地解決了遞送問題

[58-59]

。

3 體外編輯細胞的適應性

經過編輯的細胞移植到體內後的命運與基因治療的療效息息相關， 若已編輯的細胞相對於未編輯的細胞具有更強的適應性， 必將促使編輯後的細胞具有生長優勢， 如此即使編輯的細胞數量很少， 移植到體內也可以起到治療的作用。近期有報道指出，移植後的造血幹/祖細胞一部分克隆可以獨立於連續供應的上游多能祖細胞而存活， 維持語系偏向的輸出， 也就是說， 有可能只要對這一小部分的細胞進行編輯，便可以達到治療效果

[60]

。

除了針對造血幹細胞進行基因編輯用於治療血液和免疫缺陷類疾病， 近來越來越多的報道將基因編輯系統作用於其他型別的幹細胞。例如， Ger- ald Schwank等

[61]

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對體外培養的腸幹細胞進行同源重組， 對CFTR基因座進行了校正。校正後的等位基因在克隆擴增的類器官中表達出有功能蛋白，為單基因遺傳缺陷患者原代成人幹細胞同源重組基因校正提供了理論依據。 2013年， Wu等

[62]

將CRISPR/Cas9系統成功地應用於精原幹細胞（spermatogonial stem cell，

SSC

）， 透過選 擇出攜帶所需基因型且沒有脫靶突變的SSC系，讓攜帶純合遺傳缺陷的父親可以100%產生健康後代， 為父系遺傳疾病的治療提供了新的策略。然而，對於生殖細胞的編輯將會面臨嚴肅的倫理道德問題， 在這方面的倫理體系和長期安全觀察結論完善以前， 此類基因編輯僅僅只能停留在實驗室研究階段。

4 基因編輯療法的安全性

在基因治療的發展歷程中也曾發生過一些嚴重的安全問題， 致使基因治療的發展在很長的一段時間內停滯不前。2008年， JCI雜誌報道了4例因基因治療而導致白血病產生的案例。這4名患者都參與了一項利用逆轉錄病毒治療重整聯合免疫缺陷 （SCID-X1）的臨床試驗。雖然感染了逆轉錄病毒的 CD34+細胞的確將健康的IL2RG基因帶入了患者體內且達到了治療SCID-X1的效果。但是由於病毒載體自身帶有增強子元件， 病毒隨機整合到了LMO2（3 例）和CCND2（1例）這兩個基因附近， 使這兩個基因異常表達， 從而導致白血病的產生

[63]

。因此， 如今在進行類似幹細胞基因治療時都有必要檢測病毒載體是否在原癌基因處有隨機的插入。

幹細胞或iPS細胞經過體外培養後可能累積潛在的致癌突變被認為是幹細胞治療的主要障礙之一。人類iPS細胞的染色體不穩定性在2010年首次被報道， 常見的是12號染色體三體， 它可能有助於多能幹細胞增殖和重程式設計的選擇性優勢， 同時也是睪丸生殖細胞腫瘤的標誌

[64]

。2014年， 1名患有滲出性年齡相關性黃斑變性（exudativeage-relatedmacular degeneration， AMD）的日本女性移植了由自體面板成纖維細胞經iPS誘導後分化成的視網膜色素上皮細胞， 這是基於iPS細胞的細胞療法首次在人體進行臨床試驗。然而一年後， RIKEN叫停了這項試驗， 因為他們在給第2位患者移植之前在iPS細胞中發現了突變， 突變包括3種單核苷酸變異（SNV）和3種複製數變異（CNV）， 其中1個SNV列在癌症體細胞突變的資料庫中，與單一癌症有關。儘管當時經移植治療的第1位患者並沒有表現出嚴重的副作用， 但相關研究者仍表示需要小心跟蹤患者足夠長時間觀察任何不良細胞的生長情況

[65]

。

除此之外，幹細胞的致癌性也有可能是由微環境和幹細胞的突變共同引起， 2014年， 1名患有急性髓性白血病的日本男性接受了 HLA匹配成功的外周血幹細胞移植，但在27個月之 後， 白血病復發，經診斷復發是由供體來源的IDH2和DNMT3A突變造成的。雖然這兩種突變在供體中尚未造成白血病， 但由於

移植後骨髓擴增迅速以及患者同時接受免疫抑制治療, 這兩點造成了免疫監控系統缺陷,導致了供體白血病細胞在移植後的受體中迅速發展[66]

。

對於基因編輯策略而言, 最大的擔憂是具有潛在的脫靶安全隱患[67-68]

。在幹細胞中發生的低頻脫靶可能並不會立刻導致相應的表型產生， 但是從長遠的角度看卻埋下了隱患。儘管利用預測軟體能夠分析出與靶點相似的潛在脫靶位點， 還是有研究表明， 在一些非典型PAM位點或者與靶點相似度較低位點仍然有可能有脫靶現象發生

[4]

。全基因組測序分析對於機率極低的脫靶現象也很有可能出現假陰性的結果。近幾年， 隨著CRISPR/Cas9技術的發展也催生出了許多靈敏度極高的體內、體外實驗方法以幫助檢測潛在的低頻脫靶位點， 例如DIG seq、 Circle-seq、Guide-seq等

[69-

。這些方法在臨床治療時的合理運用將會對臨床實驗的安全性起到重要的作用。

5 展望

回想半個世紀以前， 人類剛剛開啟破譯遺傳密碼的旅程， 對於多種遺傳病的病因還毫無頭緒。而如今我們己經能夠編寫遺傳密碼、修復一些致病DNA突變。ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9這些工具的迭代出現幫助基因編輯領域取得了長足的進步

[72]

。隨著這些進步我們關注的焦點也己經從發現病因逐漸轉向了運用新的技術和工具治癒這些遺傳疾病。在這之中， 效率和安全問題一直是我們關注的兩大焦點。在效率問題上， 一方面可以透過改進或選取合適的遞送方式提高基因編輯工具進入細胞的絕對量。例如針對不同的靶器官選取不同的AAV型別；利用電轉RNP的方式提高細胞體外編輯的效率同時降低脫靶

[73];

選取合適的奈米材料遞送mRNA形式的基因編輯工具等

[20]

。另一方面科研人員也在對人工核酸酶系統進行不段的最佳化， 大範圍核酸酶與TALEN技 術的聯合運用

[74]

； CRISPR系統PAM序列的拓展

[75-76]

以及新型CRISPR工具的不斷開發

[77-79]

； sgRNA與供體DNA的不同修飾

[51,80]

， 這些都有助於提高核酸酶產生DSB的效率或者拓展新的位點。在安全性上， 人們也在不斷開發新的“保真型”CRISPR工具從源頭降低脫靶機率

[81-83]

，而不斷出現的新型脫靶檢測技術也有助於研究員檢測和篩選編輯後的細胞。

同時，我們也必須看到CRISPR系統帶給我們的並不僅僅是一把DNA剪刀，透過不同的融合蛋白， 它還能夠進行單鹼基編輯、基因表達的調控和表觀遺傳修飾。結合不同的遺傳疾病拓展這些新工具向臨床領域的轉化，關乎到是否有更多的遺傳疾病能夠從基因治療領域獲益。當然針對不同的新工具還必須開 發相應的安全評價體系。雖然在短期內我們還不能做到高效、安全地靶向人體內的各個器官，但是幹細胞離體分離技術和類器官離體培養技術己經逐漸發展起來。如今除造血系統之外， 肝臟幹細胞、小腸幹細胞和它們各自的類器官培養技術都日趨完善

[84-86]

，

如何將基因編輯技術和這些技術聯合起來將會是基因編輯向臨床基因治療轉化的關鍵因素之 一。對於細胞介導的基因治療而言, 除了血液系統可以進行有效的移植和重建外,如何將編輯改造後的細胞有效地整合到實體器官也是今後要重點研究和探討的科學問題

。

基因編輯的興起， 改變了以往對基因和細胞療法的定義， 為解決許多疾病提供了新的思路和契機， 但基因編輯介導的細胞治療仍面臨著安全性的挑戰， 隨著新工具的開發和利用， 這些技術上的問題都將會得到解決。技術的進步往往推動倫理的發展， 這就要求科學家恪守倫理道德， 合理利用基因編輯工具造福人類。

製版人： 小嫻子