細胞培養具體步驟（非常有用）續

鏈黴素0.1ml含鏈黴素多少

四、細胞培養用液的配製與消毒

器材與試劑：乾粉型培養基、胰蛋白酶，青黴素、鏈黴素。 純淨水系統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟：

（一）水的製備

細胞培養用水必須非常純淨，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純淨水

（二）PBS的製備與消毒（也可用於其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配製）

1。溶解定容：將藥品（NaCl 8。0 g，KCl 0。2 g，Na2HPO4-H2O 1。56 g，KH2PO4 0。 2 g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然後把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000 ml，搖勻即成新配製的PBS溶液。

2。移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，並插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒後要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。

（三）胰蛋白酶溶液的配製與消毒

胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8。0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質可降低胰酶的活性，所以配製胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

1。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0。25%，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7。2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置於4℃內過夜。

2。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超淨臺內用注射濾器（0。22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然後分裝成小瓶於-20℃儲存以備使用。

（四）青、鏈黴素溶液的配製於消毒

1。所用純淨水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2。具體操作均在超淨臺內完成。青黴素是80萬單位/瓶，用注射器加4 ml滅菌雙蒸水。鏈黴素是100萬單位/瓶，加5 ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

3。使用時溶入培養液中，使青鏈黴素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克

（五）RPMI1640的製備與消毒

1。溶解、調PH值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中，並用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一併加入培養基中），充分攪拌至粉劑全部溶解，並按照包裝說明新增一定的藥品。然後用注射器向培養基中加入配製好的青鏈黴素液各0。5 ml，使青鏈黴素的濃度最終各為100單位/ml。然後用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7。2左右。最後定容至1000 ml，搖勻。

2。安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不鏽鋼濾器和支架連線好。然後卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3。抽濾：配製好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超淨工作臺內過濾。

4。分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置於4℃冰箱內待用。

5。使用前要向100 ml培養液中加入1ml谷氨醯胺溶液（4℃時兩週有效）。

（六）血清的滅活

細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘後，再經過抽濾方可加入培養基中使用。

（七）HEPES溶液

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩衝劑，能較長時間控制恆定的pH範圍。使用終濃度為10-50 mmol/L，一般培養液內含20 mmol/LHEPES即可達到緩衝能力。

1 mol/L HEPE緩衝液配製方法如下：準確稱取HEPTS 238。3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝後4℃儲存。注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配製，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20 mmol/L 。如：稱取4。766克HEPES溶於20 ml三蒸水中，過濾除菌後可完全（20 ml）加入1 L培養液中，或者每100 ml培養液中加入2 ml即可。

（八）谷氨醯胺

合成培養基中都含有較大量的谷氨醯胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨醯胺合成核酸和蛋白質，谷氨醯胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配製各種培養液中都應該補加一定量的谷氨醯胺。由於谷氨醯胺在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配製，置於-20℃冰箱中儲存，用前加入培養液。加有谷氨醯胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨醯胺。一般培養液中谷氨醯胺的含量為1～4 mmol/L。可以配製200 mmol/L谷氨醯胺液貯存，用時加入培養液。配製方法為，谷氨醯胺2。922 g溶於三蒸水加至100 ml即配成200 mmol/L的溶液，充分攪拌溶解後，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃儲存，使用時可向100ml培養液中加入1 ml谷氨醯胺溶液。

（九）肝素溶液的配製

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中最終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0。56克/瓶，配製時，可將其溶於100ml三蒸水中，定容，過夜，然後過濾除菌，分裝小瓶，儲存溫度為℃。使用時，向100ml培養液中加入1ml（精確可加入0。9ml）即可。

（十）Ⅰ型膠原酶

0。1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃儲存。

（十一）明膠溶液

因為明膠難於過濾，所以配製0。1%明膠溶液必須用無菌的PBS配製。所以製備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0。1克（配成100ml溶液）-即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0。1的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然後無菌分裝入50ml小瓶中， 4℃儲存。

（十二）其他培養用液的配製：

20ug/ml內皮生長因子

注意事項：

1。配製溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2。安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0。45微米 和0。22微米濾膜各一張，放置位置為0。45的位於0。22微米的濾膜上方，並且要特別注意濾膜光面朝上。

3。配製RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值最終為7。2，可在配製時調PH至7。4。

五、細胞傳代培養（消化法）

具體操作：

（一）傳代前準備

1。預熱培養用液：把已經配製好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2。用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超淨工作臺和雙手。

3。正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便於操作而且可減少汙染。

4。點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5。準備好將要使用的消毒後的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。

6。取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好後方能放入超淨臺內。

7。從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的檯面，再在鏡下觀察細胞。

8。開啟瓶口：將各瓶口一一開啟，同時要在酒精燈上燒口消毒。

（二）胰蛋白酶消化

1。加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。

2。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連線成片，表明此時細胞消化適度。

3。吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

（三）吹打分散細胞

1。吹打製懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2。吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3。平衡離心：平衡後將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。

4。棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞製成細胞懸液。

（四）分裝稀釋細胞

1。分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

2。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低於5×105/ml。最後要做好標記。

（五）繼續培養

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋鬆瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時後開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積佔培養瓶底面積25％時為一個＋，佔50％為＋＋，佔75％時為＋＋＋。

傳代細胞培養注意事項：

1。嚴格的無菌操作

2。適度消化：消化的時間受消化液的種類、配製時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連線變鬆散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0。02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0。20g，NaCl 8。00g， KCl 0。20g， KH2PO4 0。02g， 葡萄糖 2。00g，0。5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7。4。注意EDTA不能被血清中和，使用後培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。

六、細胞的復甦

細胞復甦的原則——快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體操作

（一）實驗前準備

1。將水浴鍋預熱至37℃

2。用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超淨工作臺檯面。

3。在超淨工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

（二）取出凍存管：

1。根據細胞凍存記錄按標籤找到所需細胞的編號。

2。從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

（三）迅速解凍

1。迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，並要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2。約1-2 min後凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超淨臺內。

（四）平衡離心

用架盤天平平衡後，放入離心機中3 000r/min 離心3 min。

（五）製備細胞懸液

1。吸棄上清液。

2。向離心管內加入10 ml培養液，吹打製成細胞懸液。

（六）細胞計數

細胞濃度以5×105/ml為宜。

（七）培養細胞

將複合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5%CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）後換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

2。水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

3。離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

4。一次復甦細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉汙染。

七、細胞計數

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分佈時，透過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

具體操作：

（一）準備工作

取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層後以被使用。

（二）細胞懸液製備

細胞懸液的製備方法是用0。25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌後，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打製成待測細胞懸液。

（三）細胞計數

1。蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特製的蓋玻片蓋在血球計數槽上。

2。製備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0。4%）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液後就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。

3。將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然後吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4。

統計

四個大格的細胞數：將血球計數板放於顯微鏡的低倍鏡下觀察，並移動計數板，當看到鏡中出現計數方格後，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16箇中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。

5。計算原細胞懸液的細胞數：按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝ （ 四個大格子細胞數/4） ×2×104

說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以2因為細胞懸液於染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：

1。0 mm（長）×1。0 mm（寬）×0。1 mm（高）＝0。1mm3 而 1 ml＝1 000mm3

（四）細胞計數要點

1。進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低於104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮於少量培養液中；

2。要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

3。取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

4。 數細胞的原則是隻數完整的細胞，若細胞聚整合團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5。 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

（五）初學者易犯的錯誤

1。 計數前未將待測懸液吹打均勻。

2。 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

3。 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

（六）本實驗特殊試劑的配製：

4%臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃儲存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0。4%即可。

八、細胞的凍存

1。先將凍存管放入4℃冰箱，約40 min。

2。接著置於-20℃冰箱，約30-60 min。

3。置於-80超低溫冰箱中放置過夜。

4。置於液氮罐中長期儲存。

5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1。使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至於降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配製時最好戴上手套操作。

2。不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度範圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。

3。注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時新增。