過敏原特異性 IgE 抗體檢測試劑盒的臨床研究指南
過敏原特異性 IgE 抗體檢測試劑盒的臨床研究指南
董勁春（國家食品藥晶監督管理局醫療技術審評中心。北京10044）
關鍵詞∶過敏原；臨床研究；體外診漸試劑；臨床試驗方案
標記免疫分析與臨床 2011年6月第18卷第3期
過敏性疾病是患者吸入或攝入含有致敏成分的物質（稱為過敏原或變應原，llergen）後觸發機體的B細胞產生過量的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）。當IpE抗體在體內再次接觸過敏原時就與過敏原交聯結合到肥大細胞和嗜鹼性粒細胞表而上的高親和受體 FceRI 上，導致 FceRI 聚集，使肥大細胞和嗜鹼性粒細胞活化。肥大細胞在活化過程中脫顆粒並釋放儲存在細胞漿顆粒裡的炎性介質組胺，與透過花生四烯酸途徑合成的自三烯，免疫反應性前列腺素和L4、IL-5等細胞因子及趨化因子，引發過敏反應（或稱變態反應）的疾病症狀，如過敏性哮喘、桔草熱，蕁麻疹，過敏性鼻炎、混疹、過敏性皮炎、結膜炎及胃腸道功能障礙等。
過敏性疾病的診斷方法有體內（in vivo）和體外（in vitro）檢測兩種。
體內檢測，最普遍使用的是皮試方法，包括皮內試驗、點刺。皮試方法靈敏、特異、快速、價廉、易於操作，是過敏性疾病檢測致敏過敏原的常用方法之一。點刺是將含過敏原蛋白的點刺液滴在患者的面板表面，用針或帶針裝置刺穿表皮，讓過敏原蛋白滲透入皮下與機體反應，觀察可能產生的潮紅風團，指示何種過敏原激發 IgE。 介導的陽性過敏反應。由於體內檢測直接觀察患者的生物學影響，因此檢測結果與IgE 抗體密切相關。
體外檢測，根據酶標記抗體的底物體系選擇不同，有熒光、化學發光及可見光檢測體系；根據固相載體選擇不同。有醋酸纖維素圓片。聚苯乙烯塑膠微孔板，惰性載體的磁性粒子等；但它們均屬於酶聯免疫吸附分析（enzymwe-linked immu-nosorbent assay，ELISA）方法範疇。
過敏原特異性 IgE。抗體檢測試劑盒的一般檢測原理是根據所使用的方法學不同而變化的。特定的過敏原結合於固相支撐物，如酶標微孔板、玻璃、磁化粒子或其他情性物表面。將患者的血清加入固相材料孵育。過敏原與患者樣品中的特異性 IpE 抗體結合，然後洗去剩餘的血清和非過敏原特異性IgE抗體。加入標記的抗 IgE抗體的交聯劑，第二次孵育，孵育期間，過敏原-患者的過敏原特異性抗體lgE-標記的抗 IgE抗體的三明治式複合物生成。再清去未結合的標記抗體，測定的剩餘標記抗體直接與患者的過敏原特異性抗體IE成比例。
但是該類試劑檢測的臨床靈敏度和特異性是否能滿足臨床使用的安全性和有效性還沒有得到充分的評價，至今已透過國家藥監局批准註冊的檢測項且還很少，而且正在註冊過程中的一些專案所進行的臨床研究也不是很全面，臨床方案的制定不甚合理，因此對該類產品的臨床試驗首先應制定合理的臨床方案。臨床試險方案的制定對於整個臨床試驗是否成功或能否充分評價產品檢測的臨床效能都非常重要。臨床試驗方案的制定應該科學、客觀並且易於操作，應全面考慮各方面影響因素以便更充分的評價產品臨床效能。
1 臨床試驗方案的制定
1。1 臨床研究單位的選擇
過敏原檢測專案的臨床應用並不是很普及，因此建議選擇從事過過敏原專案檢測、實驗室條件較好、實驗室人員綜合素質較高的臨床單位進行臨床試驗。臨床研究單位的選擇應充分考慮地域性差異。由於過敏原檢測專案很多，包含各種食物性、吸入性，接觸性等過敏原，而且過敏症狀的發生存在季節性，所以應充分考慮各種過敏原的地域性差異、發病時間的不同、流行病學的差異選擇有代表性的單位進行臨床試驗。應儘量選擇不同省份的臨床單位，至少選擇三家以上的臨床試驗單位進行臨床研究。
1。2 臨床病例的選擇
主要選擇懷疑為過敏性疾病的患者。包括有過敏症狀、過敏性疾病病史等的患者。試驗過程中還應選擇部分正常健康人群的樣本作為對照。臨床試驗的樣本應包括有部分干擾因素、交又反應的樣本。部分干擾素包括對檢測產生干擾的脂血、溶血、黃疸樣本，該類樣本必須包括不同濃度的干擾物質。此外還應包括對檢測產生干擾的高濃度 RF、ANA樣本，IgG、IgA、IgM、人血清白蛋白等樣本。交叉反應樣本應包括與被測物有同源性、引起相似臨床症狀等的患者樣本，以進一步驗證產品檢測的特異性。臨床實驗患者的選擇應考慮不同的性別、年齡、民族、過敏症狀的嚴重程度等。臨床試驗的樣本量應滿足每個過敏原檢測專案不少於 1000 例的樣本數，其中有過敏症狀的陽性樣本應為S0% ～60%，正常健康人群樣本20%~30%，干擾樣本以及交叉反應樣本佔10%~20%。每種型別的檢測樣本的數量都應符合統計學要求，應可以分別進行統計。對於陽性樣本應儘量選擇不同陽性程度的樣本，高、中、低陽性樣本的數量應儘可能均勻分佈，以便更好的評價產品的效能。應注意低通度陽性樣本的選擇，儘量多選擇 Cut-off值附近的陽性樣本，此類樣本可以更好的評價產品檢測效能。既需明確樣本的選擇依據、入選標準、排除標準和剔除標準，還需明確樣本採集、儲存。運輸方法等。
1。3 臨床試臉淡體設計方案
三家臨床試驗單位的臨床設計方案應基本一致，除了樣本量可能存在差異之外，其它內容應一致，且三家臨床試驗單位的檢測樣本數應基本一致。對照試劑、質控品、校準品和試驗用儀器的選擇也應該一致，三家臨床單位選擇的對照試劑、質控品、校準品的批號也應一致。
臨床試驗方案一旦制定完成，必須嚴格遵照執行，不得隨意改動，如確因某種原因需要改動，必須詳細闡述更改原因、理由、更改內容等，如無充分理由，臨床試驗方案在臨床試驗過程中是不允許改動的。
對擬進行臨床試驗的申報產品，應在臨床環境中先對產品的檢測基本效能進行驗證。對於定性檢測產品應驗證其陽性參考品符合率、陰性參考品符合率，最低檢出限、精密度等效能；對於半定量和定量檢測產品應驗證準確性、線性範圍、重複性、分析靈敏度、特異性，參考品符合率等效能。驗證的專案可根據產品的註冊產晶標準進行，效能驗證合格後再進行臨床試驗研究。
對國內已有同品種批准上市的產品，必須選擇已批准上市的臨床上公認的質量較好的產品作為對照。應驗證申報產品與已批准上市產品的等效性。對照試劑應儘可能選擇與申報產品檢測原理相同而且檢測效能與申極產品相近的試劑。對於定性檢測產品應選擇Cut-off 值接近的對照產品；對於半定量，定量檢測試劑應選擇線性範圍、檢測靈敏度，參考範圍接近的產品，這樣才能更好的評價申報產品的效能。另外對照產品包被抗原的情況也應進行詳細描述。由於同一種過敏原檢測專案，可能過敏原中存在多種蛋白或多種形式的抗原，對照產品包被的抗原種類、活性、立體結構等均應描述清晰，應儘可能選擇包被抗原一致的試劑作為對照試劑。對照試劑選定後採用同步盲法進行樣本的檢測，檢測完成後再對試驗資料進行統計分析。
應驗證申報產品檢測結果與臨床診斷結果的一致性，以驗證產品檢測的臨床靈敏度和特異性如何。選擇 100 例左右的臨床病例，包括診斷為過敏原過敏的臨床病例和非過敏人群，臨床診斷應有客觀的診斷依據，如患者自述接觸史或病史，體內檢測方法如激發試驗或皮試等的檢測結果，無論是過敏病例還是非過敏人群都應透過上述臨床診斷方法明確確定是有病或是沒病。確定後對患者樣本進行檢測，檢測後與臨床診斷結果進行詳細的比對，以給出臨床檢測的靈敏度和特異性。對於一些罕見的過敏原，病例數可以適當減少，但也應具有統計學意義。
對於國內沒有同品種批准上市的產品。可以選擇境外已批准上市的臨床公認的質量較好的產晶作為對照產品，最好選擇美國FDA批准的已上市產品，第三方確認試劑也可採用國際上公認質量較好的產品。方案設計與已有同品種攪準上市的產品一致，但是應增加與臨床診斷結果進行比較的病例數，因為未在中國境內上市的產品沒有在中國境內進行過詳細的臨床研究，其產品中包被的過敏原可能與中國境內的過敏物質存在一定的差異，同樣的過敏物質可能存在蛋白、抗原結構或種類上的差異，這種差異可能導致檢測結果存在較大的差異，因此必須驗證檢測結果與臨床診斷的一致性。建議增加到 200 例與臨床診斷結果比較的試驗例數，對於檢測結果與臨床診斷結果不符的病例，應進行詳細的統計和分析，給出可能導致檢測結果不符的原因和理由。
現在臨床使用產品檢測的樣本型別一般為血清或者血漿，如果單獨申報血清或血漿作為檢測的樣本型別，只需進行血清或血漿樣本的檢測即可，如申報產品的檢測樣本型別為血清和血漿兩種樣本型別，應分別進行不同樣本型別的臨床試驗，每種樣本型別均應進行1000 例以上的臨床試驗。另外還可選擇 100 例左右的病例，每個病例分別抽取血清和血漿兩種樣本型別，使用申報產品對同一個病例的血清和血漿分別進行檢測，檢測過程應採用盲法，檢測結束後再對同一病例的血清和血漿檢測結果進行一致性分析，並對100個病例進行統計分析，給出檢測結果的一致性程度。
對於申報產品與對照產品檢測結果不符的樣本應採用其它方法進行進一步的驗證。臨床試驗評價的重點應該是對檢測不符樣本的評價，這些樣本真正反應申報試劑的效能與對照產品存在差異的大小。檢測結果不符首先是指申報產品與對照產品檢測結果的陰、陽性存在差異，其次對於半定量或者定量檢測的產品除檢測結果的陰、陽性存在差異外，對於檢測數值相差過大的樣本也屬於檢測結果不符的樣本。對於檢測不符的樣本首先應採用臨床診斷結果進行對比，以分析到底是申報產品還是對照產品的檢測結果錯誤，同時還應選擇另一個質量較好的第三方試劑進行進一步的確認，以對申報產品與對照產品檢測陰、陽性不符和檢測數值的差異進行確認。經過與臨床診斷和第三方確認試劑檢測結果的比對可以更好的評價電報產品的臨床檢測效能。
在進行臨床試驗的全過程中都應保證試驗的質量受控。無論是申報試劑還是對照試劑在每次進行臨床試驗前均應進行校準、質控品檢測。以確保檢測系統處於正常的工作狀態。同時還應對臨床試驗人員進行充分的培訓，使臨床試驗人員對申報產品和對照產品的檢測原理，檢測方法、檢測步驟、檢測的注意事項等都進行充分的瞭解，確保整個臨床試驗過程在嚴格操作下進行，除臨床試驗人員外，其他無關人員不可干涉試驗過程，包括申報產品的企業人員。
臨床試臉結果的資料統計和分析。對於定性檢測的產品，應先對產品檢測的陰、陽性符合率進行統計，採用四格表的方式進行列表展示，並進行Kappa 檢驗。對於半定量和定量檢測試劑，首先應進行定性結果的陰、陽性符合率的統計分析，採用四格表的方式進行列表展示，並進行 Kappa 檢驗，同時還要進行定量結果的統計分析，包括相關性分析、同歸分析，給出兩組資料的相關係數、迴歸方程、檢測結果的散點圖，並對相關係數和迴歸方程的斜率進行顯著性分析。對於實驗過程中檢測不符的資料應對每一對不符資料進行詳細說明。列出檢測不符資料與第三方確認試劑和臨床診斷結果的詳細比對結果，並對檢測不符可能的產生原因進行說明。
臨床試驗方案中應對臨床試臉的成功與否給予標準，必須給出明確的量化指標，如申報產品與對照產品是否等效的標準，此指標一旦確定不可隨意更改。指標的確定應該科學合理，可以正確評價產品的臨床檢測效能。
2 臨床研究報告的撰寫
臨床試驗分報告和總結報告的封面、編寫格式和報告內容應完全符合《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求。
臨床試驗報告的撰寫重點應包括以下內容；①進行臨床試驗的臨床單位名稱、試驗科室、臨床研究主要人員等內容，並說明所選臨床試驗單位的原因和依據。②此次進行臨床試驗的檢測專案，過敏原特異性 IgE抗體檢測試劑可以按單個專案進行申報，也可以將不同的過敏原包被於同一個載體上進行組合檢測，因此臨床試驗報告中首先應對進行臨床試驗的檢測專案進行明確。③臨床試驗所選病例的基本情況介紹，應針對不同的檢測專案分別介紹病例選擇的依據、病例的來源（科室》、病種分佈、病例納人和排除的標準及健康人群的入選情況和入選標準，建議採用列表或圖示的方式給出具體例數和百分數。對於病例的排除和剔除情況進行具體說明。選擇病例的基本資訊。如性別、年齡、民族、患病情況等，並進行列表。臨床試驗的例數，，包括患病樣本例數和健康人群樣本例數，還要詳述干擾樣本以及交叉反應樣本的例數。並對干擾樣本和交叉反應樣本的具體情況進行搞述，包括干擾樣本干擾物的濃度、被測物的濃度。交叉反應樣本所含的交叉物質種類，濃度和被測物的濃度等。④臨床檢測的樣本型別、樣本採集，儲存、運輸方法等。⑤對照試劑、第三方確認試劑以及檢測所用機型的縣體資訊。包括試劑名稱、生產廠家、試劑規格、試劑批號、有效期、儲存條件、註冊情況等，並詳細描述試劑的預期用途、檢測樣本型別等主要內容。⑥）臨床試驗的質量控制方法，詳細措述儀器日常維護情況、每種試劑的質量控制方法、質控品檢測的頻率、校準情況，並應提供詳細的質控和校準圖表。同時還要介紹試臉人員的培訓情況，並提供記錄。⑦臨床試驗的具體方法、試驗過程、步驟、持續時間等內容。
2。1 臨床試驗資料的統計分析
詳細描述進行統計分析的分析方法和分析用軟體，對每種過敏原分別進行統計分析，並給出試驗資料的統計結果。對於試驗中的異常值、缺失值如何進行處理，試驗過程是否涉及方案的修改等情況進行說明。
（1）定性結果
分別計算陽性符合率、陰性符合率、總符合率，並以四格表的形式進行列表，並對定性結果進行 Kappa 檢驗以驗證檢測結果的一致性。見表1。
（2）半定量或定量結果
對兩組資料進行相關性分析，給出相關係數，進行迴歸分析給出迴歸方程和試驗資料的散點圖，並對相關係數和迴歸方程的斜率進行顯著性分析。提供以下統計資料∶相關係數r、決定系R²、迴歸方程Y=aX+b、散點圖，r與a的顯著性分析結果。
（3）檢測結果與臨床診斷結果的一致性分析
將檢測結果與臨床診斷結果進行臨床靈敏度、臨床特異性、總符合率的計算，並以四格表的形式進行列表。見表2。
（4）半定量和定量結果的定級結果，並給出定級結果的分析列表，國際上公認的特異性 IgE 抗體濃度和定級標準的關係見表3。
將兩組檢測資料按以上定級標準分別進行定級，並給出定級結果資料列表。見表4。
表4 只是對所有資料的總彙，對於定級結果不一致的樣本，應逐個羅列每個樣本兩種試劑的定級結果。見表5。
（5）干擾樣本和交叉反應樣本的比較結果
給出干擾樣本和交叉反應樣本的比對結果，並明確提示干擾物質濃度達到何種濃度時會對檢測結果產生干擾，交叉反應樣本是否會對檢測結果產生干擾。
（6）如申報產品的檢測樣本型別為血清和血漿，應給出同一患者血清和血漿檢測結果的一致性分析及資料。對兩組資料進行相關性分析，給出相關係數，進行迴歸分析給出迴歸方程和試驗資料的散點圖，並對相關係數和迴歸方程的斜率進行顯著性分析。提供以下統計資料∶相關係數r、決定係數R2、迴歸方程Y=aX＋b、散點圖，r與a的顯著性分析結果。
（7）檢測不符樣本的確認
檢測結果不符是指申報產品與對照產品檢測結果的陰、陽性存在差異，對於半定量或者定量檢測的產品除檢測結果的陰、陽性存在差異外，對於檢測數值相差過大的樣本也屬於檢測結果不符的樣本，也就是檢測結果定級差異過大，一般定級相差兩個級別時認為差異過大。對檢測不符的樣本首先應進行重複檢測，重複檢測結果仍然不符的樣本，需採用第三方確認試劑進行進一步驗證，並列出檢測結果。見表6。對於樣本檢測不符的原因應進行詳細的論述，找出導致產生檢測差異的原因。
2。2 臨床試驗總結報告應對臨床試驗的所有資料進行統計和分析，並給出所有資料的統計和分析結果。
2。3 臨床試驗結果的總結和討論
對臨床試驗情況作總體的描述，並可以對試驗中的特殊問題進行說明。對臨床試驗結果包括陽性符合率、陰性符合率、總符合率、臨床靈敏度、臨床特異性、與對照試劑定量檢測結果的相關性、血清和血漿檢測是否存在差異等進行簡要說明，並明確說明該產品與對照產品是否等效或者優幹對照產品，同時給出與臨床診斷結果的一致性程度，最後明確申報產品是否符合臨床使用的需求。