運用LC-MS非靶向代謝組學探究青蟹適應急性鹽度變化的主要因素

前言

2021年11月，

寧波大學海洋科學學院王春琳團隊

在

Frontiers in Marine Science

期刊發表了題為

“Metabolic Changes in Scylla paramamosain During Adaptation to an Acute Decrease in Salinity”

的研究成果，透過

LC-MS非靶向代謝組學

研究方法，發現了氨基酸和能量代謝是參與青蟹適應鹽度變化的主要因素，而脂質代謝物起輔助作用。

基本資訊

中文標題：

青蟹在適應鹽度急劇下降過程中的代謝變化

研究物件：

青蟹

發表期刊：

Frontiers in Marine Science

影響因子：

4。912

發表時間：

2021年11月2日

合作單位：

寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室

運用生物技術：

LC-MS非靶向代謝組學(由鹿明生物提供技術支援)

研究背景

青蟹是一種廣鹽甲殼類動物，廣泛分佈於從印度洋到西太平洋地區，包括中國東南沿海地區，它對鹽度的突然降低極其敏感。青蟹生活在鹹水和鹹水河口，成熟的雌性遷徙到近海繁殖，而這些地區容易受到大雨或水環境大規模變化的影響，導致鹽度急劇下降。大幅度降低鹽度可能會超過青蟹調節滲透壓的能力，從而導致死亡。因此，青蟹適應急性鹽度降低的生物學機制需要進一步的探索。

研究思路

研究方法

1。實驗分組

（1） CK組： 海水鹽度為23 psu、溫度為20°C

（2） LS組： 海水鹽度為3 psu、溫度為20°C

2。鰓中血清滲透壓和酶活性的測定：ELISA檢測

3。

LC-MS非靶向代謝組學分析

研究結果

鹽度急速降低對青蟹血淋巴滲透壓的影響

鹽度從23下降到3 psu後，青蟹的血淋巴滲透壓開始迅速下降，在6 h達到最低點606。50 mOsm/kg HO，然後開始上升，在24 h達到最高點，在它緩慢下降並在 48 小時後穩定之前（圖 1A）。

圖1 | 鹽度對青蟹血淋巴滲透壓的影響。

（A）顯示了鹽度變化下青蟹滲透壓的變化；

（B）是青蟹和海水的滲透壓等滲圖。在（B）中，D1和C1分別是青蟹在鹽度23和3的血淋巴滲透壓，C2和D2分別是23和3 psu的海水滲透壓。

海水鹽度為 23 psu時，海水的滲透壓 （D2） 為 601。75 mOsm/kgHO，青蟹血淋巴的滲透壓 （C2） 為726。75mOsm/kg HO（圖 2B ） ； 當海水鹽度降至 3 psu 時，海水的滲透壓（D1）為 77。18 mOsm/kgHO，青蟹血淋巴的滲透壓為 642。38 mOsm/kgHO（圖 2B）。可以看出，在3~23 psu的環境中，青蟹的滲透壓始終高於海水的滲透壓，並且青蟹的滲透壓不會隨著海水滲透壓的快速下降而大幅度降低。

圖2 | 鹽度對青蟹鰓離子轉運酶活性的影響

* 表示不同鹽度下離子轉運酶活性同時存在顯著差異。

鹽度急速降低對青蟹鰓中參與滲透壓調節相關酶活性的影響

對當鹽度從23 psu降至3 psu時，Na-K-ATPase活性在6 h後升高至31。53 U/mL，該值明顯高於CK組。24 h 後活性逐漸下降，最終達到 24。28 U/mL 的平衡狀態（圖 2A）。CA 活性在前 6 小時內增加，此後保持在此穩定狀態。此外，LS組的CA活性（16。54 U/mL）顯著（1。8倍）高於CK組。V-ATPase 活性在前 6 小時內增加，達到 21。88 U/mL，然後穩定下來（圖 2）。

鹽度驟降引起青蟹鰓的代謝物變化

採用

LC-MS非靶向代謝組學

檢測CK和LS蟹鰓代謝組的變化。經過資料處理，共檢測到 16，261 個質譜特徵訊號，鑑定出 4，023 種代謝物。鰓提取物的可檢測代謝物含有脂肪醯基、羧酸及其衍生物、甘油磷脂等。

圖3 | LC-MS非靶向代謝組學分析

在 ESI （+） （A）和 ESI （-） （B）中來自QC樣品的鰓樣品的BPC；青蟹的CK和LS的PCA得分圖（C）、OPLS-DA 得分圖（D）和響應排列測試（E）。

研究者運用主成分分析（PCA）、質量控制 （QC） 等進一步證實了資料的可靠性。PCA結果顯示CK組和LS組有比較明顯的分佈規律（圖3C）。同時，OPLS-DA 模型顯示兩組之間的差異顯著（x 軸方向），所有樣本點均在 95% 置信區間內（圖 3D）。透過對OPLS-DA模型的擬合檢驗，可以發現模型對樣本的解釋能力［R2Y（cum）］和預測能力［Q2（cum）］分別為0。992和0。944。此外，直線的斜率較大，Q2 的截距為-0。646，說明 OPLS-DA 模型沒有超出擬合（圖 3E）。綜上所述，OPLS-DA模型具有良好的解釋和預測能力，能夠真實反映不同樣本組之間的差異。以上結果均表明，與23 psu海水相比，3 psu海水條件下青蟹鰓的代謝物發生了明顯變化。

篩選差異代謝物

之後研究者透過多維分析、一維分析和火山圖分析（圖4A），篩選出LS組和CK組之間的差異代謝物。共篩選出LS組519種不同代謝物，其中上調代謝物288種（表2），下調代謝物231種（表3）。

圖4 | 差異代謝物篩選

（A）LS和CK組差異代謝物火山圖紅色原點代表顯著上調的差異代謝物，藍色原點代表顯著下調的差異代謝物，灰色原點代表差異不顯著的差異代謝物；青蟹鰓組織中CK和LS的差異代謝物分類餅圖：（B）上調差異代謝物和（C）上調差異代謝物。

不同代謝物的代謝途徑分析

研究者透過差異代謝物的代謝途徑富集分析，共得到63條代謝途徑，其中有13條重要的代謝途徑，分別為氨基酸代謝/其他氨基酸代謝、訊號轉導、碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝、核苷酸代謝（嘌呤代謝）、膜運輸、核苷酸代謝、訊號分子和相互作用，以及脂質代謝（圖 5A）。此外還有包括氨基酸代謝/其他氨基酸代謝，碳水化合物代謝等50 個非顯著富集代謝途徑。從分類可以發現，顯著代謝途徑和非顯著途徑均主要與氨基酸、訊號轉導和能量代謝有關。

圖5 | 青蟹鰓組織中適應低鹽度的代謝途徑分析

餅圖分類：顯著富集（A）和非顯著富集（B）；青蟹適應低鹽度的前 20 種代謝途徑的代謝組檢視圖（C）。

透過 GC-MS/LC-MS 進行相關性分析

為了更全面地揭示青蟹對低鹽度的適應代謝機制，研究者對

GC-MS和LC-MS

進行了相關性分析。發現甜菜鹼、牛磺酸、天冬醯胺和天冬氨酸等與滲透調節相關的氨基酸出現上調。並且它們之間存在很強的正相關關係。此外，這四種氨基酸與富馬酸、6-磷酸葡萄糖酸、PC（15：0/20：5）、PE（18：2）、PS［O-20：0/18：1（9Z） ］，其他代謝物與 LysoPC（20：4）、LysoPC（18：1）、LysoPC（20：5）、乙醇酸、咪唑丙烯酸等呈正相關，均下調，呈強負相關（圖6）。

圖6 | 前50種不同代謝物的相關性分析圖；

相關性分析圖表示不同物質表達水平之間的相關性，紅色表示正相關，藍色表示負相關。顏色越深，圓點越大，相關值越高。

相關分析共篩選出76條通路，其中顯著差異代謝通路28條（P< 0。05）。（圖 7A、C）和 48 條非顯著差異代謝途徑（P < 0。05）（圖 7B）。

圖7 | 青蟹鰓組織適應低鹽度的代謝途徑類餅圖

相關討論

文章研究結果表明，青蟹的滲透壓並沒有隨著環境鹽度的下降而持續下降，證實了 Na-K-ATPase 和 CA能夠調節青蟹滲透平衡。

LC-MS非靶向代謝組學

的結果表明，甘油磷脂可能在青蟹滲透壓調節中起主導作用，而甘油磷脂代謝主要參與磷脂醯膽鹼（PC），磷脂醯乙醇胺（PE）、LysoPC和磷酸膽鹼的調節。在此研究中，PC是上調最多的磷脂，這表明PC在青蟹的滲透壓調節中起關鍵作用。

GC-MS 和 LC-MS 資料的相關性分析

表明青蟹滲透壓的平衡主要依靠調節離子和氨基酸。氨基酸大多以自由擴散的方式進出細胞以維持滲透平衡狀態。此外，一些與糖代謝和能量代謝相關的重要代謝途徑可能也參與了青蟹滲透壓的調節。

研究討論

在這項研究中，研究者運用

非靶向代謝組學

指出了脂質和氨基酸在青蟹適應鹽度急速下降中的作用和關係。首次闡明瞭透過細胞膜的運輸發生的細胞滲透壓調節的機制。這項研究結果可用於制定應急策略，以應對養殖環境中鹽分的急劇下降，並改進內陸低鹽度環境中的水產養殖技術。在青蟹的養殖中，在飼料中新增一定量的牛磺酸和甜菜鹼或透過相關產物增強代謝途徑，可以提高青蟹適應鹽度急速下降的能力。

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Anger， K。， Riesebeck， K。， and Püschel， C。 （2000）。 Effects of salinity on larval and early juvenile growth of an extremely euryhaline crab species， Armases miersii （Decapoda： Grapsidae）。 Hydrobiologia 426， 161–168。 doi： 10。1023/A：1003926730312

文末看點

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lumingbio

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