十問十答| 一文帶你秒懂新型 RNA 原位測序技術

德運康瑞旗下先能生物自主研發的新型 RNA 原位測序技術在國內首次推出以來，市場熱度空前，引發眾多研究領域專家的關注和興趣，本期小編彙總各方面經常提到的技術問題，方便大家快速瞭解關於新型 RNA 原位測序的的技術細節。

問1：新型原位測序 ISS 檢測靶標基因通量多少？

答：

ISS 理論通量可達 256 個 RNA靶標，目前我們已開展的專案中，檢測的基因數從幾十到上百個不等，都達到了客戶的預期結果。

問2：探針如何定製，可以針對哪些物種進行探針設計，定製探針週期多長時間？探針效能是否需要測試？

答：

探針可以根據客戶提供的基因名稱和序列進行個性化設計定製，目前探針定製主要圍繞人和小鼠模式物種開展；設計合成探針週期一般2周，探針效能可以透過試測樣本進行驗證。

問3：一個基因需要設計幾對探針，多對探針的優勢是什麼？

答：

通常一個基因會針對 5 個不同區段位點設計 3~5 對探針，探針設計數量通常會考慮到待檢測 RNA 序列的長度，如果序列比較短，通常會保證至少 3 對的設計。多個探針的靶向優勢可以相容片段化或者已部分降解的 RNA，並且可以減少某些區段靶點因空間位阻暴露不徹底所導致的該基因檢出低的情況，從而提高檢測效率和靈敏度。

問4：新型 RNA 原位測序探針的設計相比於2013年早期原位測序技術有哪些改進的地方，改進的優勢有哪些？

答：

總體來說探針設計更短了，短序列探針合成質量更高，更容易進入細胞內部，並且增加了探針雜交特異精準的與靶標分子結合，從而增加了檢出的特異性和準確性。

問5：原位測序技術可以使用哪些樣本型別？

答：

冰凍樣本（切片厚度10±1um ）FFPE樣本（切片厚度5±1um），最好儲存在3個月以內細胞爬片

問6：原位測序技術如何做到定量？

答：

根據原位測序檢測結果可以對 RNA 的檢出訊號計點定量。

問7：一張 slide 上可以實現多大面積的原位測序分析？

答：

建議10*10 mm，大面積可以考慮拼接。

問8：最終的正式實驗是否會同時進行陰、陽性對照檢測？

答：

正式實驗時，我們會利用兩張連續切片，一張用於靶標基因的檢測，一張進行陽性探針和陰性探針等質控基因的檢測。

問9：目前的已有的專案經驗做過哪些型別的樣本？

答：

已積累 200+ 例樣本專案經驗，包括：人、小鼠、大鼠以及斑馬魚等物種的 50 餘種組織型別。

人：面板FFPE樣本、永生化角質形成細胞（HaCaT）、眼角膜、肝臟組織等；小鼠：肝臟、心臟、牙切片、嗅球、眼球和骨組織等。

問10：新型 RNA 原位測序技術服務流程？

答：

(1)定製探針：

針對使用者提供的基因的非保守區設計探針併合成。

(2)前處理：

切片退凍、固定、脫水和透化便於探針和反應所需的酶等成分進入。

(3)探針雜交與滾環擴增：

探針與RNA雜交連線成環，滾環擴增放大編碼訊號。

(4)原位成像：

邊合成邊測序，採集熒光訊號得到對應位置的編碼鹼基，再進行序列解碼，識別出該位置靶向結合的基因。

(5)影象解析：

用不同符號或顏色在組織影象中標記每個靶基因在組織切片中的表達位置，並進行基礎的資料統計。

(6)高階分析：

透過細胞邊界識別方法（根據DAPI染核結果）得到單細胞水平的基因表達矩陣，基於矩陣可進行後續聚類分群等高階分析。

關於德運康瑞

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