反相色譜中有機相的選擇——甲醇or乙腈？

眾所周知，液相色譜中流動相的選擇非常重要，直接影響到色譜分離的結果。然而對於反相色譜流動相的選擇中，大家的關注點幾乎都是在緩衝鹽的選擇上，對於有機相的選擇關注的往往很少，幾乎都是甲醇乙腈隨機使用。主要是反相液相色譜中可選的有機相種類不多，絕大多數都是甲醇，乙腈再加上少部分用四氫呋喃。而實際上，有機相的選擇也非常重要，那我們應該如何選擇，是甲醇還是乙腈，還是其他？

有機相的選擇，首先考慮的是溶劑的強度和極性。溶劑的強度決定著化合物洗脫需要有機溶劑的量，在反相色譜中隨著溶劑極性的增大而減小。我們常用的幾種有機溶劑的溶劑強度分別為：甲醇2。64，乙腈3。12，四氫呋喃4。4，從數值來看幾種有機溶劑的洗脫能力甲醇<乙腈<四氫呋喃，具體對應起來如下圖所示：

從上圖中可知，如果某一化合物能在20%乙腈水的條件下洗脫下來，如果將乙腈換成甲醇，則需約28%甲醇水才能洗脫，而換成四氫呋喃，則只需15%的四氫呋喃就能洗脫。

Tips：上述只是理論上的資料，在實際實驗中，如果需達到相似的保留，將乙腈更換成甲醇，我們建議在上圖的基礎上，額外增加10%甲醇；而將乙腈更換成四氫呋喃時，則需減少5%四氫呋喃。

從三種溶劑的結構上看，甲醇在氫鍵作用下既是強的質子給予體又是強的質子接受體；乙腈具有偶極作用，在氫鍵作用下，又是非常弱的質子接受體；四氫呋喃在氫鍵作用下只能接受質子，不能給予質子。

色譜柱：Drogon 苯基柱 150*4。6mm 5um流動相：20mM磷酸二氫鉀（pH 2。5）： 有機相%（圖示）流速：1。0ml/min檢測波長：UV@220nm化合物：1。 糖精鈉 2。 對羥基苯甲酸 3。 山梨酸 4。 脫氫乙酸 5。對羥基苯甲酸甲酯

如上述實驗結果所示，在使用乙腈和甲醇分別作為洗脫溶劑的時候，出峰順序發生了變化。透過結構來看，糖精鈉是一個強的質子接受體，而苯甲酸是一個強的質子給予體，在甲醇做流動相的時候，甲醇既是一個強的質子接受體又是一個強的質子給予體，作用互相抵消，他們的洗脫是純粹依靠甲醇本身的洗脫能力；而乙腈只是一個弱的質子接受體，不能給予質子，相比之下乙腈與苯甲酸之間還多了一層氫鍵作用，因此，苯甲酸在乙腈中的洗脫更快，導致出峰順序發生了變化。脫氫乙酸和對羥基苯甲酸甲酯這兩種物質，相比而言，對羥基苯甲酸甲酯帶有苯環，而乙腈中的π電子干擾了它與苯基固定相的結合，因此出峰更快，出峰順序也發生了變化。

Tips：在用苯基柱時，使用甲醇做有機相，能更好的體現苯基的π-π選擇性。同時還可以根據目標化合物接受或給予質子的能力，挑選合適的溶劑作為流動相，能夠取得意想不到的分離效果。

除此之外，溶劑的粘度，紫外吸收截止波長也是我們選擇有機相需要考慮的內容。

溶劑的粘度影響著儀器系統的壓力，混合溶劑粘度越大，壓力越大。上圖中列出了幾種常用有機溶劑與水混合時的粘度曲線，四氫呋喃與水混合的粘度曲線與甲醇類似。Tips：在使用小粒徑和小內徑的色譜柱時，更傾向於選擇乙腈作為有機相，壓力偏低。

使用紫外檢測器時，當檢測波長低於溶劑截止波長時就會生產較大幹擾。

Tips：當波長在200nm左右時，乙腈的吸收要遠低於甲醇等其他溶劑，尤其是在梯度執行的時候，使用乙腈作為流動相，基線漂移也會遠小於甲醇，這樣得到的色譜圖不僅美觀，樣品的檢測限和方法的靈敏度也要好很多。