Real-Time PCR (qPCR)常見問題及解決方案
Real Time PCR(qPCR)，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，是一種利用熒光染劑檢測每次PCR迴圈後產物總量的方法技術，是常規PCR的衍生反應。主要是透過熒光訊號的變化實時監測PCR擴增反應中每一個迴圈擴增產物量的變化，透過ct值和標準曲線的關係對起始模板進行定量分析。因其具有靈敏、特異、精確以及使用簡便等優點，現已發展成為分子生物學研究中的重要工具。
常用術語
首先先定義幾個術語先以確保澄清事實。
基本概念
1.1 實時定量PCR的簡寫
建議實時定量PCR （quantitative real-time PCR） 應當簡寫為qPCR，反轉錄PCR （reverse transcription–qPCR） 應當簡寫為RT-qPCR。用RT-PCR簡寫表示qPCR可以引起混亂，並且與傳統RT-PCR的平常應用不符。
1.2 內參基因
內參基因應當指的是參照基因（reference genes），而不是管家基因（housekeeping genes）。
1.3 TaqMan探針
TaqMan探針應指的是水解探針（hydrolysis probes）。
1.4 FRET probe
FRET probe （fluorescence resonance energy transfer probe， 熒光共振能量轉移探針）指的是一種機制，基於2個熒光基團的電子激發狀態之間的相互作用的基礎上的發光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針（dual hybridization probes） 。
1.5 定量 quantification
牛津英語詞典只列出了定量（quantification），非定量（non-quantification），因quantification是恰當的。
1.6 Cq
現在文獻中使用的閾值迴圈（threshold cycle， Ct），交點（crossing point， Cp）和分支點（take-off point， TOP） 與PCR反應週期中的術語不一致。這些術語指的實際上在實時儀器是相同的值，只是不同儀器廠家為了競爭給自己產品的特定定義，不具有準確性和清晰性。根據實時定量PCR的標記語言的資料標準（
http：//www。
rdml。org
），建議同一使用定量迴圈（quantification cycle， Cq）這個術語。
1.7 基線（baseline）
一般預設為3~15個迴圈的訊號值就是基線（baseline），是由測量的偶然誤差引起的。
基線
1.8 閾值（threshold）
指在擴增曲線的指數增長區域內的適當位置上設定的熒光檢出界限，一般是基線的標準偏差的 10 倍。
閾值
常見問題及解決方案
1.重複性很差
造成qPCR實驗重複性差的原因有以下幾點：
① 移液槍不準，加樣不準確
這種情況下，我們可以更換效能更好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中
② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣
這個需要定期校準定量PCR儀
③ qPCR預混液未混合均勻
使用前應充分混勻qPCR預混液
注：重複性較為理想的擴增曲線STD<0。2
2.熔解曲線為非單一峰
這個可能的原因有以下幾點：
① 非特異性擴增
可以根據設計原則設計新的引物，可透過梯度 PCR 對引物退火溫度進行最佳化
② 出現引物二聚體，引物為非特異性引物
引物設計不合理導致的引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位於75℃左右，如該峰顯著請按照以下方面進行最佳化：
（A）最佳化擴增條件，可設定梯度Tm，摸索最佳的Tm值
（B）引物濃度太高，適當降低引物濃度
（C）可透過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體
③ 模板有基因組汙染
重新制備cDNA模板即可
3.Ct值出現過晚
① PCR產物太長
PCR產物不宜太長，一般100-50bp即可
② cDNA模板降解
重新制備模板，重複實驗
③ 擴增效率極低
最佳化反應條件，嘗試三步法擴增程式，或者重新設計引物
④ 反應體系中存在PCR反應抑制劑
加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重複實驗
⑤ cDNA模板濃度低
減少稀釋度重複實驗
4.內參基因Ct值正常，目的基因Ct值出現較晚
內參基因Ct值正常，說明試劑及操作步驟無誤。目的基因Ct值出現較晚，可能原因為：
① 目的基因表達量偏低--重新富集RNA
② 目的基因引物擴增效率低：
將模板進行梯度稀釋，以確定引物的擴增效率
降低退火溫度
重新設計引物
5.擴增曲線異常，如“S”型曲線
1）
反應體系引起的擴增曲線不光滑——-擴增效率偏差（過高或過低）
A. 擴增效率過高
出現非特異擴增或引物二聚體：反應體系內模板濃度太高以及模板核酸質量較差可能導致出現抑制PCR反應的現象。在絕對定量時表現擴增效率大於110%。
解決方案：
① 去除模板濃度最高的反應孔並重新分析標準曲線。如果效率重新回到110%以下，則分析良好；
② 對目的基因做標準曲線，一般用克隆該基因的質粒做梯度稀釋，或用PCR 產物做梯度稀釋，然後做定量擴增，透過曲線評估反應效率。絕對定量有效的擴增效率在90%-110%；
③ 重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。切記應延長乾燥時間，以去除乙醇沉澱過程中的乙醇，或採用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從矽膠純化物中去除。
B. 擴增效率過低
主要表現在試劑濃度不適（主要是引物、鎂離子和Taq DNA聚合酶），尤其是在多重實驗中，引物對Tm差異超過5°C 以及熱迴圈條件不合適的情況下，試管中各種同源物質的競爭作用可造成反應效率低下。絕對定量表現：擴增效率＜90%。
解決方案：對上述因素逐一排除後進行調整最佳化實驗體系。
C. 個別擴增曲線異常
如個別擴增曲線突然驟降：反應管內留有氣泡，由於溫度升高後氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。
解決方案：進行擴增反應之前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。
2）儀器設定不當引起的曲線異常
基線設定不當，如擴增曲線斷裂或下滑（基線的終點值大於Ct 值）。減小基線終點（Ct 值- 4），重新分析資料；
A.基線範圍和閾值設定不當
基線範圍和閾值都是人為設定的引數。二者一般由儀器自動預設為合適值。在對同一程式中的多種試劑盒或化學劑進行評估時，經常出現閾值設定不當造成不同組別資料的擴增曲線差異：軟體自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線，這將導致資料組中的Ct值出現偏差，因為其最佳閾值比此值更低。因此，需對每個資料組進行獨立研究，這樣才能根據具體情形選擇最佳閾值；
B.Rox 新增不當
表現為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續，需校正參比染料。
6.絕對定量時標準曲線線性關係不佳
① 加樣誤差
加大模板稀釋倍數，提高加樣體積
② 標準品降解
重新制備標準品，重複實驗
③ 模板濃度太高
增加模板稀釋倍數
7.絕對定量中透過以下引數對qPCR結果加以判定
A。相關係數（R2）：＞0。98，越接近1，結果可信度越高。R＞0。99 或R2＞0。98；
B。標準曲線斜率：-3— -3。5，100%擴增效率對應的斜率是-3。32；
C。 PCR 擴增效率（E）：90%-110%，越接近1，越理想。其對應的斜率為-3。58 至-3。10。效率= 10（-1/斜率）-1；
D。檢測靈敏度確認：35Cycles 內可得到好的定量結果，如果採用SYBR 檢測方法，30cycles 內無非特異性產物擴增；
E。 NO template control （NTC）確認：35cycles 內無引物二聚體產生；
F。 重複性：STD＜0。2。
文章來源（侵刪）：
分子生物學、細胞生物學、免疫學，論文基金申請寫作，SCI潤色。可私信溝通或V。X聯絡：
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