組會寶典——如何結構化分析一篇23分頂刊文章
本文首發於“解螺旋”微信公眾號
轉載請註明：解螺旋·臨床醫生科研成長平臺
Noncoding RNA主要包括miRNA，lncRNA及circRNA，是最近幾年的熱門研究領域。其廣泛參與生命活動的各種調節過程，且不編碼蛋白，又被稱為生物界的暗物質。miRNA目前已經研究的相對成熟，其主要作用是結合在基因的3’ UTR區，負向調節基因的表達。
LncRNA及circRNA是近期研究的主要內容， lncRNA的作用模式目前主要有Signal、Decoy、Guide及Scaffold，而circRNA作為一種更穩定ncRNA，因其富含miRNA的結合位點，可以發揮miRNA sponge的功能。miRNA sponge又被稱為ceRNA，是一種自2011年以來被廣泛研究的一種RNA間的調控機制。
今天為大家帶來一篇Circulation的文章，題目是“Circular Noncoding RNA HIPK3 Mediates RetinalVascular Dysfunction in Diabetes Mellitus”。結合題目及摘要，該文章的
疾病
是糖尿病視網膜病變，
主變數分子
是circHIPK3，
表型
是血管內皮細胞的功能（活性、增殖、遷移及成管），
機制
是ceRNA（miRNA Sponge），
科學假設
是：c-myb→circHIPK3→miR-30a-3p→VEGFC/WNT2/FZD調控視網膜血管內皮細胞的功能，從而促進糖尿病視網膜病變的發生發展。
本文論證邏輯嚴謹（補充材料中的Figure達到24個），包括了分子、細胞、動物、組織四個維度，內容包括以下幾個部分：
第一部分，包括Fig1、7、S1、S2、S3，驗證circHIPK3的表達及在糖網中的表達差異；
第二部分，包括Fig2、5、S6、S7、S8、S23，透過gain of function及loss of function驗證表型；
第三部分，包括Fig5，尋找circHIPK3上游驅動機制；
第四部分，包括Fig3、S9-15、S24，尋找circHIPK3下游調控機制；
第五部分，包括Fig4、6、S17-21，機制的表型驗證；
接下來具體看一下資料：
1. 驗證circHIPK3的表達及再糖網中的表達差異
S1、S3：血管內皮細胞中存在circHIPK3表達；S2：circHIPK3在人與小鼠直接高度保守
Fig1 circHIPK3的表達特點。A、B：組織和細胞水平驗證circHIPK3的表達；C：測序驗證序列；D、E：circHIPK3較HIPK3mRNA更穩定；F、G：circHIPK3主要定位於細胞質；H、I：在動物和細胞水平驗證circHIPK3在糖網中表達升高。
Fig7 circHIPK3在糖尿病視網膜病變患者中高表達。A、B、D：circHIPK3在糖尿病患者的視網膜前膜、房水、血清中表達升高；C：circHIPK3在糖尿病患者外周血細胞中表達不升高。
2. 透過“正反實驗”驗證表型
Fig2、S6、S7 敲降circHIPK3驗證表型。Fig2A：siRNA1、SiRNA3降低circHIPK3內源性表達；Fig2B、S6A：敲降circHIPK3抑制細胞增殖；Fig2C、S6B：敲降circHIPK3抑制細胞遷移；Fig2D、S6C：敲降circHIPK3抑制細胞遷移；Fig2E、S6D：敲降circHIPK3抑制細胞成管；S7：在高糖環境下敲降circHIPK3抑制細胞活性
Fig S8 過表達circHIPK3驗證表型。A：過表達circHIPK3；B：過表達circHIPK3促進細胞活性；C：過表達circHIPK3促進細胞增殖；D：過表達circHIPK3促進細胞遷移；E：過表達circHIPK3促進細胞成管。
Fig5 敲降circHIPK3減輕糖網中內皮細胞損傷。A：構建特異性敲降circHIPK3的shRNA；B：動物水平驗證敲降circHIPK3後糖網小鼠視網膜血管增生減輕；C動物水平驗證敲降circHIPK3後糖網小鼠視網膜血管滲出減輕。
S23：動物水平驗證過表達circHIPK3後加重糖網小鼠視網膜血管增生及滲出。
3. 機制部分，尋找circHIPK3上游驅動機制
S5 轉錄因子c-myb為circHIPK3上游驅動因素。A：c-myb在高糖環境下表達升高；B：PCR驗證敲降c-myb後circHIPK3表達下降；C：ChIP驗證高糖環境下c-myb與編碼circHIPK3基因的啟動子結合；D：Luciferase assay驗證c-myb與編碼circHIPK3基因的啟動子結合。
4. 尋找circHIPK3下游調控機制
Fig3、S9 circHIPK3與3種miRNA結合發揮調控作用。Fig3A：RIP驗證circHIPK3與AGO2結合；Fig3B：Luciferase assay驗證circHIPK3與3種miRNA存在結合；Fig3C：Rescue，突變結合位點驗證circHIPK3與3種miRNA的結合；Fig3D：RIP-qPCR驗證circHIPK3與3種miRNA存在結合；S9B：IF驗證circHIPK3與3種miRNA存在共
S12、S13 3種miRNA下游靶基因驗證。S12：PCR驗證過表達3種miRNA後VEGFC、FZD4、WNT2基因表達下降；S13：PCR驗證過表達3種miRNA後相關血管生成因子無明顯變化。
S14：Luciferase assay驗證3種miRNA與VEGFC、FZD4、WNT2的3’UTR區結合；S15：驗證敲降circHIPK3後VEGFC、FZD4、WNT2基因表達降低。
S24 circHIPK3，miR-30a-3p，VEGFC/FZD4/WNT2三者存在相互作用 A：動物水平驗證抑制miR-30a-3p增加VEGFC、FZD4、WNT2基因表達；B、C：動物水平驗證透過RIP-qPCR驗證miR-30a-3p分別與circHIPK3及VEGFC/FZD4/WNT2三者存在相互作用；D：動物水平驗證VEGFC/FZD4/WNT2表達；E：動物水平驗證敲降circHIPK3後
5. 機制的表型驗證
S18：抑制miR-30-3p增加細胞活性、增殖、遷移及成管能力；S19：高糖環境下抑制miR-30-3p增加細胞活性、增殖、遷移及成管能力。
Fig4 circHIPK3-miR-30a-3p調控視網膜血管內皮細胞功能。A：透過Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p驗證二者相互作用調控細胞活性；B：透過Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p驗證二者相互作用調控細胞增殖；C、D：透過Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p驗證二者相互作用調控細胞成管。
S17：透過Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p驗證高糖環境下二者相互作用調控細胞活性、增殖、遷移及成管。
S20：透過Rescue操作circHIPK3及VEGF驗證二者相互作用調控細胞活性、增殖、遷移及成管能力。S21：透過Rescue操作circHIPK3、WNT2/FZD4驗證二者相互作用調控細胞活性、增殖、遷移及成管能力
6. 總結
本文是一個
分子+分子+分子+分子的四元變數結構
，其中包括一組轉錄調控（蛋白-DNA互動）以及ceRNA調控（RNA-RNA互動），論證了主變數分子circHIPK3透過競爭性結合miR-30-3p調控VEGFC/FZD4/WNT2表達，而本身受到上游轉錄因子c-myb的調控，從而促進糖尿病視網膜病變的發生發展。本文分為以下幾步論證：
單變數論證
：circHIPK3、miR-30-3p調控血管內皮細胞的功能（活性、增殖、遷移、成管）及糖網中血管的增生及滲出。
二元變數論證
：circHIPK3透過miR-30-3p調控視網膜血管內皮細胞功能，circHIPK3透過VEGF/WNT2/FZD4調控視網膜血管內皮細胞功能。
直接作用論證
：透過ChIP、Luciferase assay驗證c-myb與circHIPK3啟動子區域的結合；透過RIP、Luciferase assay正反驗證miR-30-3p與circHIPK3，miR-30-3p與VEGF/WNT2/FZD4的結合。
本分之所以能發在Circulation這種心血管領域頂級期刊上，首先是由於主變數circHIPK3非常新穎，其在糖尿病視網膜病變發生發展中的作用是首次報道；其次，本文論證充分，資料紮實，包括了臨床、細胞、動物、分子四個維度，每個維度都從多個角度採用多種實驗方法來論證；而且，本文有2組直接作用機制，實驗用到了RIP、ChIP、Luciferase assay等比較高階的試驗方法；最後，circHIPK3本身存在於外周血中，且外周血中的含量與疾病具有相關性，具有進一步應用於液態活檢中的潛力。
好了，這篇文獻就分享到這裡，期待大家都能收穫好的結果。
