Nature | 微生物透過腸-腦回路調節交感神經元，調節胃腸運輸

原創 xiaoyudian 圖靈基因 今天

來自專輯 前沿分子生物學機制

撰文：xiaoyudian

IF=42.778

推薦度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮點：文章報道了腸道微生物能夠調節腸道交感神經活動和神經元群體的突觸連線的腸道，形成腸-腦回路，並進一步表徵微生物對於自主神經系統的調控，以及整合微生物訊號的額外迴路。

​

近日，美國洛克菲勒大學和日本慶應大學的研究團隊合作在《

Nature》

上發表了一篇名為“

Microbiota modulate sympathetic neurons viaa gut–brain circuit

”的文章。文中發現了微生物能夠透過腸-腦回路調節腸交感神經元和腦幹感覺核的啟用。首先透過生物模型與轉錄組、迴圈示蹤法和功能操作發現腸道微生物組調節腸道外感交感神經元，微生物群的缺失導致神經元轉錄因子cFos表達增加，無菌小鼠產生的短鏈脂肪酸抑制腸道交感神經節中cFos的表達。其次，採用化學遺傳學操作、轉錄圖譜和順行示蹤的方法識別遠端腸投射的迷走神經細胞群，其在微生物介導的腸道交感神經元調節中起傳入作用。最後利用腸壁的逆行多突觸神經元示蹤識別了在微生物消耗過程中被啟用的腦幹感覺核，以及輸出交感運動前穀氨酸能神經元，調節胃腸運輸。這些結果揭示了微生物能夠透過其依賴的腸-腦迴圈控制腸道外交感神經的啟用。

外源性腸相關神經元（eEANs）是由感覺傳入神經和自主傳出神經組成的，其在腸道功能調節方面能夠同時感知腸的多個區域，將資訊傳遞給其他組織，並補充內源性腸相關神經元（iEANs）。為了更好地描述eEANs之間的聯絡，以及它們的活性或基因表達是否受到腸道菌群的影響。本研究首先將熒光逆行示蹤劑，霍亂毒素β亞基（CTB）注入不同腸段，然後解剖投射到腸的外源性神經節，特別是感覺結節神經節和背根神經節（DRG）和交感腹腔腸繫膜上神經節（CG-SMG）（圖1a-c）。小腸區域的個體CTB示蹤顯示了左右結節偏差，以及從近端到遠端移動的交感神經支配密度的增加。來自不同腸道區域的同步CTB示蹤顯示，這些解剖上不同的腸道區域的感覺和交感神經支配是由不重疊的外周神經元細胞群介導的（圖1d）。這些結果表明了投射到腸道的感覺和效應神經的外源性腸相關神經元的分割槽。 透過轉錄譜分析，我們鑑定了微生物介導的eEAN基因表達變化。我們使用 Snap25Cre與Rpl22lsl-HA （Ribo Tag）雜交小鼠，對無特定病原體（SPF）和無細菌Snap25Ribo Tag小鼠中分離的結狀神經節、胸9 DRG和CG-SMG進行TRAP測序。結狀神經節的基因本體分析表明，在無菌小鼠中富集與突觸訊號和神經元啟用相關的基因（圖1e-g）。此外，無菌小鼠的CG-SMG顯示了的豐富的基因本體通路的可塑性和傳導性；Fos，作為一個神經元的直接-早期基因和神經元活動的間接標記，呈現出顯著的高轉錄水平（圖1f-h）。免疫熒光實驗表明，與SPF相比，從無菌鼠中分離出的CG-SMG的免疫熒光分析顯示出更多的cFos+神經核 （圖1i-j）。這些資料表明，微生物群的缺失導致腸-外源性交感神經活動水平的升高。

為了確定特定的微生物是否能夠介導CG-SMG神經元的緊張性抑制，實驗中採用了多種微生物操作策略。將SPF級供體的糞便移植到無菌小鼠體內，可以將CG-SMG神經元的cFos恢復至SPF相當的水平，表明微生物可以抑制腸道外交感神經元（圖2a）。僅存的活細菌不足以抑制腸投射的交感神經的啟用，隨著分節絲狀細菌（SFB）、嗜粘桿菌或脆弱擬桿菌在無菌小鼠中的單克隆化，不能夠導致CG-SMG cFos水平的降低，而在無菌小鼠體內定殖確定的細菌群會導致SPF值的升高（圖2b-c）。相反，使用廣譜抗生素去除SPF小鼠的微生物群，導致CG-SMG中cFos+神經元的增加（圖2d-e）。個別抗生素的治療足以驅動交感神經cFos表達，總體上表明特定的細菌亞群能夠抑制cFos的啟用（圖2f）。此外，單次灌胃鏈黴素12小時可導致CG-SMG神經元啟用，24小時快速灌胃可在治療5天后恢復到基礎水平（圖2g）。

接下來，為了確定被啟用的交感神經細胞是否投射到腸道，本研究將熒光CTB注射到經廣譜抗生素治療的FosGFP小鼠的迴腸中。透過實驗發現CG-SMG中CTB+（紅色）和cFos+（綠色）神經元的共定位（圖2h），這說明在微生物消耗時啟用的交感神經元投射到腸道的可能性，但不排除投射到與CG-SMG相連的其他內臟組織上。最後，我們發現，在微生物衰竭小鼠中，抑制兒茶酚胺的釋放恢復了胃腸運動的改變。這一結果表明，增加的交感神經活動在一定程度上導致小鼠的運動障礙（圖2i-l）。上述實驗結果表明，特異性的微生物可以抑制腸道交感神經元中cFos的表達，而腸道特異性的交感神經活動可以反映腸道微生物群落的變化。

與腸道感染誘導的cFos和短鏈脂肪酸（SCFA）水平之間缺乏相關性相比，在每一種無菌操作的SCFA水平，都與CG-SMG中cFos+神經元的數量相關聯。因此，在實驗中測試了在微生物群落衰竭小鼠中補充SCFAs是否能恢復其CG-SMG中的cFos水平。SCFAs可透過血腦屏障，但腦室內灌注SCFAs不能抑制CG-SMG中鏈黴菌素誘導的cFos。此外，給予三丁酸甘油酯，能夠抑制鏈黴素誘導的無菌小鼠和SPF小鼠的CG-SMG神經元cFos的表達，但對盲腸重量無影響。因此，SCFAs抑制交感神經cFos的能力有可能由外圍過程引起的。SCFAs可以透過啟用G蛋白偶聯受體，包括GPR41、GPR43或GPR109A，抑制組蛋白去乙醯化酶或作為能量底物來調節靶細胞。透過Gpr41-/-小鼠進行實驗發現，其他微生物調控的代謝物也在交感神經調節中發揮作用。進一步的結果，SCFAs和額外腸相關的代謝物或體液因子作為生理調節啟用腸交感神經。 然後透過對CG-SMG上游的神經元群或迴路進行研究發現，中樞神經系統依賴神經迴路。然後選擇在SPF小鼠迴腸或結腸中注射表達單核紅色熒光蛋白（mRFP）的偽狂犬病毒PRV-614來研究腦幹中相關的交感神經前運動區。注射PRV-RFP後第4天腦組織的影象清除分析鑑別了連線到腸的幾個腦幹核多突觸（圖3a-c）。艾倫腦圖譜原位雜交資料庫的搜尋表明抑制性GABA神經元和興奮性穀氨酸能神經元可能參與調節腸交感神經元。將PRV-RFP注入Slc32a1L10-GFP和Slc17a6L10-GFP小鼠的迴腸，顯示RFP+ / GFP+神經元的共定位，大多數巨噬細胞神經元被鑑定為VGAT+，胞外側核/延髓頭端腹外側神經元被鑑別VGLUT2+，其他神經遞質的貢獻較小（圖3d-g）。不同腸段的雙PRV示蹤顯示，每個腦幹區域的大部分神經元連線到多個腸段（圖3h）。這些實驗定義了一組共同的輸出前運動腦幹神經元，它們多突觸能夠連線到腸的不同區域，並可能控制腸道交感神經活動。 為了識別和永久標記抗生素治療後最近啟用的神經元，實驗中將FosTRAP2：tdTomato小鼠可塑性對映和熒光PRV結合，注射至近端結腸，標記腸投射神經元。與cFos的增加一致，能夠觀察到小鼠中LPGi/RVLM中的TRAP+細胞的百分比增加。為了直接確定這些腦幹群體是否調節腸道交感神經活動，雙側注射DREADD至LPGi/RVLM of VGATCre或VGLUT2Cre小鼠的Gi中。口服C21，野生型或 （Gi） VGAT小鼠並不影響基線運動測量，但（LPGi /RVLM）VGLUT2小鼠的腸道運輸和糞便顆粒輸出顯著減少，CG-SMG cFos相應的增加（圖3i-p）。上述結果表明，穀氨酸LPGi/RVLM腦幹神經元可以驅動腸道交感神經活動，從而減緩胃腸運輸。

在注射PRV後的第4天，對資料的分析發現先前顯示的其他腦幹區域與胃和直腸相連，特別是背迷走神經複合體包括迷走神經的背運動核（DMV）、孤束核（NTS）和後腦區。鏈黴素治療後，發現NTS和後腦區的cFos表達整體增加（圖4a）。此外，將鏈黴菌素處理的小鼠給予三丁酸甘油酯後抑制了後腦區的cFos水平，而NTS水平增加。這表明在生態失調或微生物消耗狀況下，額外的SCFAs和未知內臟訊號可能在NTS感知，但後腦區仍作為腸道SCFAs的潛在的遠端感覺中樞。這些結果顯示了一組腦幹感覺核的特徵，這些感覺核可能被用來檢測腸道微生物群或其代謝物的變化。 微生物消耗後NTS/後腦區cFos表達增加，表明傳入感覺神經元可能在調節腸道交感神經活動中的發揮作用。針對結狀神經節或DRG感官活動，使用SNShM4Di小鼠，發現給予C21 能夠顯著的誘導CG-SMG神經元啟用（圖4b）。為了確定這種表型是由結狀神經節單獨抑制還是和DRG共同抑制引起的，實驗中首先使用化學和遺傳消融的TRPV1+傳入的內臟投射神經元。透過實驗發現，在CG-SMG中，這種處理並沒有阻止抗生素誘導的cFos表達，在未處理的SPF小鼠中也沒有誘導cFos，這表明在微生物消耗期間，感覺DRG神經元在啟用的迴路中並不起主要作用（圖4c）。接下來，將Phox2bhM4Di小鼠注射C21，發現CG-SMG cFos+細胞的顯著增加（圖4 d）。對於這兩種小鼠針對一群CG-SMG神經元，因此我們直接對CG-SMG神經元進行選擇性化學遺傳學操作。 結果顯示，未能啟用CG-SMG神經元的SNSCre靶標小鼠的結狀神經節的基因Scn5a豐富（圖4e-f）。原位雜交與遠端腸道逆行示蹤表明部分遠端腸道投射結狀神經節神經元確實為Nav1。5+（圖4g）。這些化學遺傳、示蹤、TRAP和消融實驗表明，調節特定的迷走神經傳入足以驅動腸道交感神經活動。

將熒光PRV注射到sdVx小鼠結腸壁上，可標記左右結狀神經節，且偏向右，與CTB從遠端小腸示蹤觀察到的趨勢一致（圖4h）。最後，迷走神經傳入投射的視覺化揭示了遠端腸神經元過程的密集標記，表明感覺傳入神經元從結狀神經節投射纖維到高微生物負荷或SCFA濃度的區域（圖4i-j）。上述實驗結果表明迷走神經調節能夠啟用上述識別的感覺腦幹核。總的來說，本研究的結果確定了一個腸-腦-腸迴路，透過該回路，不同的微生物和微生物代謝物調節腸交感神經元和腦幹感覺核的啟用，從而能夠整合腸特異性刺激。這可能是理解腸道動力、內臟疼痛、腸道免疫和與腸-腦軸相關的系統性疾病的調控的關鍵，該研究為確定治療策略提供非常重要的參考和指導。

教授介紹

Daniel Mucida，美國洛克菲勒大學粘膜免疫學實驗室副教授。在腸道內壁的表面，小腸上的淋巴細胞能夠清除侵入性病原體，保護腸道，同時也避免不受控制或過度的免疫反應，導致過敏和嚴重的炎症性腸病。在健康的腸道中，免疫系統在反應性和耐受性之間維持平衡。該研究小組目前致力於探討腸粘膜相互競爭背後的免疫活性和耐受機制以及來自腸腔的線索傳播的方式。另一個主要的研究重點是白細胞的發展和功能；同時還研究了免疫細胞的功能是否會影響區域性或遠端連線的神經元的活動及這種神經免疫通訊是如何幫助控制炎症的，它的缺失是如何導致組織損傷和炎症紊亂的。

參考文獻

1。 Paul A。 Muller， Marc Schneeberger， Fanny Matheis， et al。 Microbiota modulate sympathetic neurons viaa gut–brain circuit。 Nature。 （2020）。