細胞爬片必備技能完整版

細胞爬片就是讓玻片浸在細胞培養基內，細胞在玻片上生長。主要用於組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞塗片，原位雜交等。

細胞爬片的準備

1蓋玻片的選擇：

爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；

2爬片的剪裁：

可根據自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色剪裁成合適大小，置於6孔板、12孔板或24孔板；

3爬片的使用前處理：

將剪裁好的爬片，置於濃硫酸中浸泡並過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置於無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗乾淨就可以了，如果不乾淨的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養皿中烘乾後進行高壓消毒。高壓後取出放入烤箱中烤乾，備用。烤乾後可放入超淨臺中。

4多聚賴氨酸的使用：

很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做後續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

細胞爬片的操作

1。胰酶消化細胞後計數重懸細胞於完全培養基中。

2。加細胞前，根據玻片的大小，先在每個孔裡準備放爬片的位置滴少量培養基，使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然後放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。（整個過程注意無菌操作）

3。根據自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養板內即可。

4。待細胞貼壁後，可去上清加含藥培養基。

5。按照實驗設計，作用一定時間後取玻片。取玻片時由於玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。

細胞爬片的固定

另外在儲存細胞爬片的時候，一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然後再放爬片，這樣方便做實驗時取片。

細胞爬片取出後，一般用PBS洗2遍，然後再做固定。當然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。

然後蓋上蓋子，並在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃儲存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

常用的固定液

1

冷丙酮

——可用於一般的免疫組化染色。

——將純的丙酮預先放入冰箱-20℃後便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬片取出後，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮於-20℃（丙酮有很強的揮發性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發）

——固定10分鐘，取出後，室溫吹乾，然後放入-20℃儲存。

2

多聚甲醛（常用4%）

——可用於免疫電鏡、免疫熒光以及TUNEL染色。

——主要檢測組織內一些效能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇（CD）、主要組織相容性抗原等

——室溫固定15分鐘後，將表面液體吹乾，入-20℃儲存

3

95％乙醇

——可用於免疫組化。

——優點：穿透性強、抗原性儲存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質儲存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定後可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。

——室溫固定15分鐘後，將表面液體吹乾，入-20℃儲存

4

甲醛（福爾馬林）

——應用廣泛。

——優點：形態結構儲存好，且穿透性強，缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果

——室溫固定15分鐘後，將表面液體吹乾，入-20℃儲存。