什麼是基因組Survey？為什麼要做基因組Survey？

為什麼要做調研圖

基因組測序現在已經成為生物學研究的一個重要手段，基因組的雜合度和重複序列對後續基因組組裝有很大的影響。高雜合的基因組往往無法合併姊妹染色體，導致組裝的結果偏大，而重複序列在組裝中會被摺疊，使組裝中出現缺口、錯誤，導致組裝的結果偏小。不同的生物體的基因組之間雜合率和重複序列含量差異巨大，因此在進行基因組測序前往往需要對基因組的特徵進行調研，以確定測序方案，週期等。目前常用的調研手段有三種：

用流式細胞儀測定細胞核內的DNA總量

用核型分析方法，識別染色體數量、倍性

用調研圖，透過二代測序，估算基因組大小、雜合度、重複序列比例、GC含量等。

不同的技術手段有不同的側重，其中調研圖以低成本，低難度和更多的評估內容成為使用最多的技術手段，同時調研圖所測的二代資料還可以用於回比基因組，以評估組裝質量。調研圖是基於數學統計學手段獲取物種資訊的方式，因此對於已經研究的較為清晰的物種——主要是普通二倍體和簡單多倍體，其染色體條數、倍性、大概基因組大小是已知的，此時僅選擇調研圖就足以滿足瞭解基因組特徵的需要，但對於多倍體複雜基因組更推薦補充核型分析和流式的結果，以和調研圖相互印證補充。

調研圖原理(以二倍體調研圖為例)

評估基因組大小

調研圖最重要的用處是對基因組的大小進行估計。，對於沒有測序錯誤的理想情況下，用測序資料估算基因組大小可以按照這個公式：基因組大小=測序量/reads平均覆蓋深度。但由於測序錯誤的存在，較長的reads非常容易受到錯誤的影響，而將reads切碎為“長度為k的片段”，即k-mer，能大大減輕這個問題，因此調研圖繪製的是k-mer的深度-頻率分佈圖。此時估算基因組大小的公式就變成了：基因組大小=正常kmer數量/k-mer平均覆蓋深度。因為錯誤總是隨機出現的，所以這裡正常的k-mer數是過濾掉過低頻率的k-mer（即錯誤）後得到的數量。在理想狀態下，K-mer曲線服從泊松分佈，即只會出現一個明顯的主峰。但對於一個雜合二倍體，主峰前1/2出會出現一個雜合峰，在雜合度較高的時候可能出現高過主峰的情況。下圖即為一個高雜合二倍體kmer的頻率-深度分佈圖。主峰後二倍位置內的峰為重複峰。但如果雜合度很低，可能分佈圖中只有一個峰存在。主峰所代表的就是k-mer平均覆蓋深度，用主峰深度代替公式中的k-mer平均覆蓋深度即可算得該基因組的大小。

Figure 1，一個二倍體的kmer頻率-深度分佈圖，橫軸為深度，縱軸為kmer出現的頻率，主峰位於深度100左右，雜合峰位於深度50左右

k-mer也並不是切的越小越好，過短的k-mer將無法保證多數k-mer在基因組中只出現一次，導致主峰深度估計偏大，而較長的k-mer具有跨越更長重複片段的能力，因此

k-mer的選擇其實是一個平衡錯誤和重複的過程

。通常k的選擇為15到21的奇數，既能夠保證k-mer的種類能覆蓋基因組，又足夠小以避免錯誤的影響。基因組中往往還存在一些重複序列，這些重複序列也會引起kmer的重複，但這些重複的存在雖然會削低主峰的高度，卻不會改變主峰的位置，上圖主峰後的小峰即為重複峰。

評估雜合率和重複序列

前面已經提到了雜合率的高低對基因組的組裝有非常大的影響，那麼如何計算基因組的雜合率和重複率呢？通常有兩種不同的方法，一種是

直接計算峰的面積

，即上圖中雜合峰和重複峰的面積佔總面積的比例，從而估算出雜合率和重複率。另一種是

透過模型擬合各個峰

。genomescope21就是一個透過負二項分佈擬合基因組k-mer分佈來評估基因組特徵的工具，其結果被普遍認可。以下圖為例，一個二倍體的genomeScope分析結果。

藍色

柱子是kmer的觀測值；

橙紅色

擬合線部分對應著深度過低的kmer，這些kmer被認為是測序錯誤引入的；

黑色

擬合線是除去被認為是錯誤的部分（橙紅色擬合線部分）之後剩下的所有k-mer，這些被認為是可靠的kmer資料；

黃色

擬合線被認為來自基因組非重複區域的K-mer分佈；

垂直的黑色虛線

為預測最低深度峰的整數倍覆蓋度；

Figure 2一個二倍體的調研圖，橫軸是測序深度（覆蓋度），縱軸是k-mer出現的頻率，主峰位於100左右。

多倍體調研圖

多倍體又分為異源多倍體和同源多倍體，其調研圖的情況更為複雜。以四倍體為例，異源四倍體又被稱為雙二倍體，從k-mer分析的角度來說，其調研圖和二倍體並無太大差異。雖然如此，他們的染色體之間仍然存在一定的相似性，所以在主峰二倍的位置上往往存在一個小的凸起，這樣的凸起和高重複率的二倍體調研圖非常接近。如下圖是一個異源四倍體的調研圖：

Figure 3一個異源四倍體的調研圖，主峰位於212深度，三個峰的比例為1：2：4

同源四倍體的兩套亞基因組之間的區別比異源四倍體更為接近，體現在調研圖上就是在主峰的二倍位置處有一個明顯隆起的峰。如果存在一定的雜合率，調研圖上就會存在三個比例為1：2：4的峰，但如果基因組的雜合率很低，雜合峰不明顯，此時調研圖看起來和二倍體仍然非常接近。不同的倍性對整套基因組的大小影響不大，所以面對多倍體時，調研圖的結果最好同時結合流式細胞儀或者核型來判斷。對於雜合率約在0。5%~20%左右，重複序列不超過約40%的物種，也可以利用smudgeplot軟體1對雜合k-mer進行分析，得到可能的物種倍性，從而輔助基因組雜合率和重複序列的估計。Smudgeplot透過尋找雜合k-mer來研究基因組的倍性，其定義的雜合k-mer對指的是一對k-mer之間只相差一個鹼基，且沒有第三個k-mer與他們再相差一個鹼基（如ATGATCA， ATGCTCA， ATGGTCA）。對於一個AB形式的雜合，smudgeplot試圖從所有k-mer中尋找一對雜合k-mer，而對於一個AAB形式的雜合，smudgeplot試圖尋找兩條相同的k-mer和一條它們的雜合k-mer，在圖中表示為更高的亮度。如下圖對一個四倍體的smudgeplot分析，可以明顯的看出AABB雜合模式附近的k-mer數量明顯高於其它k-mer，左上角也描述了這個結果。

Figure 4一個四倍體的smudgeplot分析結果，橫軸是雜合k-mer對的深度佔總深度的比例，縱軸是所有k-mer對的總深度，二者的交點即代表了不同的雜合結構。交點的亮度代表了落入其中的k-mer數。

需要注意的是，調研圖一般需要50x以上的資料對基因組進行評估，在測序深度不足的情況下，調研圖可能無法很好的形成真正意義上的峰，此時最好的選擇是加測資料，重新繪製調研圖進行評估。

［

1

］ Ranallo-Benavidez， T。R。， Jaron， K。S。 & Schatz， M。C。 GenomeScope 2。0 and Smudgeplot for reference-free profiling of polyploid genomes。

Nat Commun

11,

1432 （2020）。