一文掌握測序峰圖|如何看懂測序峰圖?如何進行測序結果的分析？

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幾個簡單的概念：

QV：鹼基的質量值（Quality Value，QV）用於量化評估該鹼基的可信度，由序列分析程式根據該鹼基的峰形計算得出。QV值越高，誤差率越低。

QS：測序結果的序列質量得分（Quality Score， QS）是序列中所有鹼基質量值（Quality Value）的平均值，用於判斷測序結果整體的可信度。

CRL：序列連續讀長（Contiguous Read Length，CRL）。即整個序列中，各個鹼基質量值均大於20（可信度大於99%）的片段裡，最長片段的長度。

針對常規質粒樣品，通常以QS和CRL值作為判定測序結果是否成功的參考。

常見的幾種測序結果的峰圖：

1. 正常峰圖特徵描述：峰形比較完整，基本為單一峰形

2.無訊號峰圖特徵描述：序列峰圖雜亂無章，測序干擾較大，沒有明顯主峰

3.衰減峰圖特徵描述：起始峰圖良好，逐漸出現底峰干擾主峰讀值

4.中斷峰圖特徵描述：序列中含有特殊結構或因GC含量高導致測序中斷——中斷峰圖例項

5.套峰峰圖特徵描述：測序峰圖為非單一峰型，稱之為套峰

6. 彌散峰圖特徵描述：峰形過寬，無法準確讀值

7. Poly結構或重複序列峰圖特徵描述：序列中含有Poly結構導致非特異套峰或中斷

◆ Poly A結構導致此區域後面產生非特異性套峰

◆ GT重複序列導致此區域後面產生非特異性套峰

Poly結構或重複序列峰圖例項

如何優雅的進行測序結果的分析。

小編以自己的正反向測序結果為例，為大家講解：

該目的片段是一段CDS，比較長，因此我選擇構建到T載體上，利用T載體上的M13引物進行測序，已達到完全覆蓋CDS的效果。

1。使用Snapgene建立理論序列DNA檔案

將理論序列貼上到Snapgene中，儲存為DNA檔案：

2。刪除測序結果中的seq檔案，免得其干擾我的思路。在理論序列檔案中，點選Tools →align multiple sequences，選擇正、反向測序的ab1檔案。這樣就得到了理論序列與正反向測序峰圖的比對圖：

從比對結果圖中可以看到，正向測序結果（藍色右箭頭）有4個空白，即4個位點與理論序列不符；而反向測序結果（藍色左箭頭）有1個不符。接下來，詳細分析這幾個不匹配的位點。

3。 點選Sequence標籤，切換到序列頁面，找到不匹配的位點，這裡推薦將ab1檔案的峰圖開啟：

可以看到，第一個不匹配的位點，正反向測序均實現了覆蓋：

正向測序的峰高非常矮，並且出現了套峰，從而產生誤讀；相比之下，反向測序的峰形十分標準，因此，綜合判斷，該處反向測序的結果更為可信，即該處沒有發生突變。

4。 點選圖中按鈕，可以迅速查詢到下一個不匹配鹼基，可以看到，正反向測序的峰形都很標準，也就是說這裡的確是實際序列與理論序列不一致，點選“預測編碼蛋白”按鈕，還可以看到該突變位點在CDS編碼蛋白氨基酸序列中的位置，即GAT變為GGT，編碼氨基酸由天冬氨酸變成了甘氨酸。

可以在這裡新增Feature，進行記錄：

本文轉自公眾號BioMan