Lec8 熒光與熒光顯微術

Lec0 生物醫學光學緒論

Lec1 光與組織的相互作用

Lec2 Jablonski Diagram

Lec3 波動光學I

Lec4 波動光學II

Lec5 波動光學III

Lec6 組織光學性質及擴散光學成像

Lec7 光學相干層析成像

Lec8 熒光與熒光顯微術

Lec9-1 顯微鏡基礎

Lec9-2 流式細胞儀

Lec10 非線性光學成像

Lec11 4Pi顯微鏡

Lec12 單分子探測、跟蹤、STORM成像

Lec13 超分辨成像

Lec14 FRET原理和應用

熒光

熒光是一種光致發光的冷發光現象。

吸收與發射光譜

生色團：

分子中吸收光的集團，通常是芳香環。吸收波長與生色團尺寸有關。較小的髮色團（較短的共軛長度），較高的能量（較短的波長）

熒光的吸收光譜（或稱為激發光譜）描述了某一波長的光對於樣品的相對吸收機率，而發射光譜則描述了熒光發射後在不同波長的光強分佈。

熒光光譜具有以下特性：

斯托克斯位移

電子從基態躍遷到激發態時候所需要的能量往往要大於電子從激發態返回基態的能量。主要是因為激發態分子內部的振動弛豫和內部轉移。位移是吸光度最低能量峰與發射最高能量之間的能量差。

斯托克斯位移

熒光發射光譜形狀與激發光譜形狀無關

，都從第一激發態回落。

熒光發射光譜與吸收光譜成映象關係。

激發光譜：

不同波長入射光激發熒光物質，在熒光最強的波長處測量熒光強度，激發波長-x，熒光強度-y

發射光譜：

固定激發光波長，測定不同波長的熒光強度。

熒光壽命

熒光發射強度隨著上能級電子數呈指數衰減，

τ為熒光分子壽命，一般為1-10 ns

其他引數

吸收係數：ε（波長）

量子產率：

熒光發光強度

在熒光分子未達到飽和之前，總的熒光光強可表示未：

飽和激發速率

光漂白

熒光被強光照射後，部分熒光分子的電子被激發到三線態，很容易被氧化導致無法回到基態。

對抗光漂白的方法：

短掃描時間

高放大倍率，高數值孔徑的鏡頭

減弱激發強度

使用antifade reagent，降低氧氣濃度，不適用於活細胞成像。

猝滅

熒光猝滅（quenching）不是化學過程。

動態猝滅和靜態猝滅

熒光探針

應用

熒光染料在科研中常用於熒光免疫、熒光探針、細胞染色等。包括特異性的DNA染色，用於染色體分析、細胞週期、細胞凋亡等相關研究。另有很多核酸染料在多色染色系統中是非常有用的復染劑，可作為背景對照，標記細胞核使細胞內結構的空間關係一目瞭然。

在免疫分析中熒游標記的單克隆抗體技術為流式細胞儀在研究細胞膜和細胞內各種功能性抗原、腫瘤基因蛋白等領域擴充套件了無限的應用空間。熒光探針可以透過蛋白質交聯劑共價結合在單克隆抗體上。

在核酸檢測中熒光染料對細胞核染色後定量測量細胞所發出的熒光強度，就可以確定細胞核中DNA、RNA的含量，並可以對細胞週期和細胞的增殖狀況進行分析。有多種熒光染料可以對細胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶（PI）、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

熒光抗體技術是以

熒光物標記抗體進行抗原定位的技術

。 本技術較其他鑑定細菌的血清學方法有速度快、操作簡單、敏感性高等特點，它在臨床檢驗上已用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等。