技術丨化學發光免疫分析中羧基與Tosyl磁珠包被抗體方法及注意事項

作者：由 MBL北京發表于農業時間：2022-10-28

化學發光免疫分析與磁珠

化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，透過抗原抗體的免疫反應檢測各項標誌物的免疫分析技術。該技術廣泛用於傳染病，心臟疾病，腫瘤，妊娠檢測等領域。是現階段體外診斷領域最主流的技術和趨勢。磁性微粒（磁珠）是化學發光免疫分析中的一種重要原料。常用磁珠主要是粒徑1-3um，修飾了羧基、甲苯磺醯基或者鏈黴親和素的免疫磁珠。今天小編就以JSR磁珠為例，為大家介紹一下羧基和甲苯磺醯基磁珠相關的抗體包被的方法以及影響因素。

化學發光操作步驟

羧基和甲苯磺醯基（Tosyl）磁珠的對比 ※ 羧基磁珠反應原理

羧基和EDC反應活化，形成中間體，中間體和抗體的氨基反應，將抗體連線在磁珠表面。

※ Tosyl磁珠反應原理

抗體根據自身的疏水性逐漸和疏水的Tosyl基團靠近，達到合適距離後，抗體所攜帶的氨基和Tosyl基團發生自然反應，將抗體連線在磁珠表面。

※ 包被條件對比

Tosyl磁珠

羧基磁珠

活化

無需

需要

催化劑/反應促進劑

硫酸銨（不參與反應）

EDC（參與反應過程）

反應溫度

37℃

室溫

反應時間

18-24 h

1-3 h

偏鹼

偏酸

封閉要求

高

一般

磁珠包被方法以及影響因素

※ 羧基磁珠包被流程（說明：以下步驟中IgG單位應為ug）

※ 羧基磁珠包被影響因素1步法中影響發光值的因素：

① Buffer的PH值

：1步法對PH值非常敏感。PH值不合適會出現聚集、包被效率低等問題。

1步法中包被效率比較高的PH條件為4-6。5，考慮到抗體的穩定性，一般在5-7條件下進行包被在下面的A、B、C三個不同的專案中，用控制變數法對PH值進行討論。

A專案

B專案

C專案

可以看出：A、B專案均在PH5時發光值最高。A專案中PH6的發光值接近PH5；而B專案中PH6條件對比PH5，發光值減半；C專案中PH6時發光值最高，而僅僅改變了0。5的PH5。5條件下的發光值已經減半不同專案對PH值的敏感度不同，最適條件也不同，需要做梯度探討。

②EDC用量：

1步法對EDC的用量也是非常敏感的。EDC過少會影響發光值，過多也可能會造成抗體團聚、失活、發光值下降等問題。

在以上1、2、3的三個專案中，適宜的EDC量不同，表現出來的影響趨勢也是不同的。專案1、2是隨著EDC用量的增加，發光值會增加。而在專案3中，EDC過量後，反而對發光值有負面的影響。所以不同專案對EDC的敏感度不同，同樣需要做梯度探討。

2步法中影響發光值的因素

：

羧基和氨基反應分為前後兩個步驟，羧基活化在偏酸性條件下，效率更高。活化中間體和氨基的反應在偏鹼性條件下效率更高。所以在羧基活化和抗體包被的步驟可以透過置換Buffer來調整PH值。

影響發光值的其他條件：

o Buffer的離子濃度，濃度過高容易產生團聚現象

o 封閉劑用量和封閉時間，封閉劑用量少或時間不足，容易產生本底高等問題

o 抗體用量等

兩種方法的對比：

1步法 2步法

D、E為兩個不同專案，由上圖結果可知：

D專案中透過調整PH值可以看到1步法還是2步法對發光值影響不明顯。

E專案中即使將PH值調整到最佳狀態，1步法的發光值也不如2步法。

雖然大部分專案都可以用1步法，但並非所有專案都適用，包被過程用1步法還是2步法需要進一步進行對比試驗。

※ Tosyl磁珠包被流程

※

Tosyl磁珠包被影響因素

在Tosyl磁珠和抗體結合的過程中，影響因素主要有硫酸銨用量，PH值，溫度，反應時間和封閉過程等。

①硫酸銨

：硫酸銨的新增是為了提高抗體的疏水性，以便抗體可以和Tosyl基團更好的接近。而過多的硫酸銨會造成抗體的變性，所以對於不同的專案加入多少硫酸銨的量需要單獨地去衡量。

②PH值

：Tosyl基團和氨基的反應需要在中性偏鹼的條件下進行。

③溫度和反應時間

：Tosyl磁珠包被抗體需要在37℃高溫條件下長時間反應，推薦的反應時間為18-24 小時。如果是對溫度比較敏感的抗體，可以在室溫條件反應，需要適當延長反應時間。使用Tosyl磁珠需要抗體可以在高溫環境中長時間反應而不變性。在下圖37℃和4℃條件反應的對比中，可以看出在4℃條件反應24小時，也不如在37℃反應1小時的反應度。

④封閉過程

：由於Tosyl基團本身是疏水性的，如果封閉不充分，Tosyl基團會對血清中的其他組分產生非特異性吸附，造成假陽性等問題。下圖以CE510封閉劑為例，展示了封閉與否，封閉時間的長短對本底和信噪比的改善。

磁珠的選擇

在專案開發初期，研發老師都會面臨磁珠選擇的問題，可以根據公司或研發者的使用習慣去選擇。大部分常規專案，羧基磁珠和Tosyl磁珠都是可以包被成功的。

在實際生產中，羧基磁珠使用過程工藝複雜，關鍵控制點多，包被過程中需要EDC的活化，活化情況的好壞會影響試劑的均一性。

Tosyl磁珠的特點則相反：用時長但工藝簡單，生產易控制，使用中可以避免活化步驟對試劑效能的影響。但是Tosyl磁珠也有一些侷限：①易產生非特異性吸附，影響本底。②反應條件相對苛刻，使用的抗體需要能在高溫和鹼性環境下長時間反應。所以在實際使用中可以根據抗體的特點來選擇磁珠的官能團，JSR磁珠的產品資訊詳見下表。