如何為血液病患者選擇正確的基因檢測平臺？

正文

血液病的治療，現在已經進入到一個精準治療時代了，透過檢測基因的變異狀態對疾病進行鑑別診斷、預後分層、靶向治療，已經成為一個共識，但是面對這麼多的檢測平臺，我們應該如何選擇呢？接下來，且聽我細細道來。

一代測序

一代測序就是我們常說的Sanger測序。1977年，Frederick Sanger等發明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術隨後成為最為常用的基因測序技術，並且到目前為止，都是基因檢測的金標準，人類基因組的測序正是基於一代測序技術完成的。

一代測序技術的優勢是具有高度的準確性、簡單、快捷、測序讀長長（能達到800-1K bp），但是不足之處在於通量低、耗時長。所以，目前臨床上的應用，主要是針對已知致病基因的突變位點進行擴增測序的。

所以說，如果要選用一代測序進行基因檢測，首先要明確檢測的具體位置，根據具體的位置進行引物設計，然後進行擴增、測序，最後將測序結果與標準序列比對，就可以得出該基因是否發生突變。

在血液病中，

應用一代測序比較多的也是一些特定的基因，包括：FLT3、NPM1、CEBPA、KIT、IDH1、IDH2等

，透過這些檢測，可以對患者進行預後判斷、靶向治療指導，也可以在治療過程中的進行療效監測。

值得注意的是

，一代測序的目的是尋找與疾病有關的特定的基因突變，對於沒有明確候選基因或候選基因數量較多的病例篩查是難以完成的，還有一些大片段缺失或複製數變異等基因突變的型別，一代測序也無法實現。所以這類測序研究還要依靠具有高通量測序能力的二代測序。

二代測序

二代測序又叫高通量測序

，是繼一代測序之後的革命性進步， 能夠

同時對成百上千個基因進行測序

， 實現了大規模、高通量測序的目標。

二代測序技術的優勢

是測序通量和效率高，成本低廉，資訊量豐富；但

不足之處

在於測序讀長普遍較短（150-250bp），且用時較長。

隨著技術的發展，人們已經逐漸認識到血液病的發生往往是多基因共同變異的結果，並且致病基因的研究帶動了靶向藥物的研究，越來越多的靶向藥物已經運用在了病人的治療上。這個時候，

單靠一代測序，已經遠遠不能滿足對疾病的治療與探索，而二代測序的出現，正好解決了這一難題。

在二代測序中，我們經常聽到一個詞：

Panel

，我們可以把它理解為“套餐”，血液病是一類很複雜的疾病，它有很多不同的分類，而每一類疾病可能都有幾個與疾病密切相關的基因突變，

我們把這幾個密切相關的基因打包做一個套餐，一次性全部檢測出來，這就叫一個Panel。

比如說，白血病裡最常發生的AML，與它密切相關的基因有20個，於是我們組套做成一個AML相關熱點基因檢測，對於疑似AML的患者，這一個檢測下來，我們就可以對病人做出一些判斷，包括危險度分層、是否可以服用靶向藥物，如果對這個病人進行連續監測，我們還可以判斷治療效果如何，是否好轉或惡化等等。

另外，有時我們需要對疾病進行研究，探索是否還存在一些未知的基因突變，這個時候小的Panel就不能滿足了，我們可以選用幾百個基因的大Panel，或者採用

全基因組測序、全外顯子測序等來滿足疾病的科研探索。

除此以外，二代測序還可以進行轉錄組測序，用於基因表達分析、非編碼小分子RNA的鑑定、轉錄因子靶基因的篩選，以及表觀遺傳學方面的DNA甲基化相關研究等。

熒光定量PCR

熒光定量PCR技術是在普通PCR技術上發展起來的一種新技術，藉助熒光訊號來檢測PCR產物。

因為檢測原理的限制，熒光定量PCR只能檢測一些研究成熟的基因突變，所以

臨床上常用的，是對一些熱點基因的定量跟蹤。

例如：MPN相關的JAK2、MPL、CALR基因突變等等。

但是，對於已知

融合基因的檢測，卻讓熒光定量PCR大放異彩。

在白血病中，融合基因的檢測在鑑別診斷和療效監測上的作用，已經達成了共識。尤其是BCR-ABL、PML-RARa等融合基因的檢測，已經成為

疾病診斷和療效監測的重要標誌

。而熒光定量PCR這一技術的應用，讓融合基因的檢測變得快捷、準確，而且成本低廉。

一般上對於白血病患者，初診的時候都要做一個大範圍篩查，現在市面上常用的就是43種融合基因篩查，篩查得到的融合基因，可以幫助判斷患者的疾病亞型，後續在治療過程中，可以單獨跟蹤這一融合基因，現在指南共識中已經明確推薦

BCR-ABL和PML-RARa可以用外周血作為標本來進行檢測，省去了病人骨穿的痛苦

，真正實現實時定量監測。

數字PCR

20 世紀末，Vogelstein等提出數字PCR的概念，透過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個複製的DNA模板，分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束後對各個反應單元的熒光訊號進行統計學分析。

數字PCR與熒光定量PCR同屬PCR技術，所以也

只能檢測一些研究成熟的基因突變

，但與熒光定量PCR 不同的是，數字PCR實現的是

絕對定量

，不依賴於CT值，不需要對照標準樣品和標準曲線，因此不受擴增效率影響，

檢測結果更加準確

。

數字PCR的另外一個優勢是

極高的靈敏度

，所以可以檢測到頻率很低的基因突變，在血液病上的應用主要是MYD88、BRAF等研究的相對成熟的基因。

另外，正因為靈敏度高，所以數字PCR可以檢測到外周血中的含量極少的ctDNA，這是其他技術平臺所不能達到的，所以在實體腫瘤中的應用非常廣泛，例如我們所熟知的肺癌的EGFR基因檢測等等。

小結

血液病的分子診斷，離不開各種基因檢測平臺，可是平臺多了，大家就分不清用哪個好了，其實沒有哪個是最好的，也沒有哪個是不好的，能夠充分利用各個平臺的優勢，選擇最合適的平臺進行檢測，才是我們的最終目標。