【Western-Blotting】蛋白提取與蛋白定量

在《WB樣品準備》中筆者提到了WB樣本（細胞或組織）、蛋白變性及蛋白儲存的相關要點。在此，筆者簡要介紹蛋白的提取與蛋白定量。

一、蛋白提取

1、蛋白裂解液與裂解環境

現如今，商業化的蛋白裂解有很多中，有強效的、裂解時間短（約5-10min）；也有普通的、裂解時間尚可（約30min）；也有超強效的，裂解時間極短（小於5min）。其中，上述裂解液的裂解環境，一般推薦為冰上或者4℃裂解，減少蛋白降解；而在蛋白裂解液中也推薦加用磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，抑制細胞內酶對蛋白的自然降解。

對於普通蛋白的提取，如實驗時間無特殊，選用普通的蛋白裂解液、冰上裂解即可；對於極易受環境影響的蛋白（比如低氧相關蛋白，HIF-1等），研究報道將細胞從低氧培養箱中取出2-3min即可影響HIF-1表達，因此宜選用超強效蛋白裂解液，並在低氧培養箱（37℃）中快速裂解。

2、組織蛋白提取

在組織蛋白提取過程中，一般推薦加用蛋白裂解液（磷酸酶和蛋白酶抑制劑）後，冰上研磨、勻漿化處理組織。組織來源不同，蛋白的產出亦不相同。歡迎各位留言，分享經驗，比如1mg組織能產出多少蛋白。

二、蛋白定量

1、蛋白濃度測定

蛋白定量的方法有很多種，應用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，市售的蛋白定量試劑盒也多基於上述兩種檢測方法而開發的。兩種方法均需配製蛋白標準品，蛋白與定量試劑經過一定時間的反應（BCA法反應為37℃、20-30min，Bradford法反應一般為37℃，5min），酶標儀讀取樣品的OD值，繪製的蛋白標準曲線，依據標準曲線計算WB蛋白的濃度。兩種檢測方法筆者均有使用經驗，相比BCA法，Bradford法不僅節省反應時間，也無需配置反應試劑，簡單、快速、好用，筆者推薦Bradford法測定蛋白濃度。

嚴格來說，每次的蛋白濃度測定均需配製新鮮蛋白標準品，保證每次測到的蛋白濃度的準確性。然而，WB法評估蛋白表達水平本身就是一種半定量或者相對定量，因此在實際蛋白樣本準本及濃度測定時只需保證均一性即可，即使用同樣的標準曲線計算同一批蛋白的濃度，如果計算準備即可保證蛋白上樣時內參水平基本一致。因此，在實際操作中我們只需測定一次標準品的OD值、繪製標準曲線，即可用此曲線來計算後續實驗蛋白的濃度，節省時間和試劑。

具體的蛋白定量步驟，各位朋友參考試劑盒提供的方法即可，簡單易行。至於標準曲線的繪製，網路亦可查到不是帖子介紹用不同軟體繪製標準曲線，筆者在此不做詳細介紹，。如有需要，可本帖留言。

2、蛋白濃度的調平

有研究者喜歡計算新增loading buffer及變性以後的蛋白終濃度和上樣體積，然後在蛋白上樣時用loading buffer配平，保證上樣體積基本一致。而筆者更喜歡用loading buffer和蛋白裂解液調整蛋白濃度到基本一致（一般為1-2ug/ul）以後再變性，如此蛋白上樣時只需使用相同體積的蛋白樣品即可，筆者經驗是這樣的方法相對省時且不容易出錯。