Nature Methods | 徐濤徐平勇合作在超分辨光鏡-電鏡關聯成像上取得重要進展
責編 | 兮
蛋白質等分子在細胞中的特定位置組裝成蛋白質機器進而發揮生物學功能，因此研究蛋白質等分子在細胞中的精確定位對於揭示蛋白質機器的組裝和分子機制至關重要。電子顯微鏡具有亞奈米尺度的空間解析度，是生命科學領域中不可缺少的研究工具。然而
在電鏡影象中定位目標蛋白具有很大的挑戰
。例如常用的免疫電鏡利用抗原—抗體反應在電鏡影象中標記和定位蛋白質，該方法標記效率低，而且對抗體的特異性依賴性很大。光鏡-電鏡關聯成像技術
【1,2】
是一種雙模態成像技術，該技術利用光鏡成像來定位目標分子，標記效率和特異性高，同時還可利用電鏡對細胞進行超微結構成像。近年來出現的超分辨光鏡-電鏡關聯
【3,4】
是更先進的光電關聯技術，其中超分辨光鏡打破了光學衍射極限，將成像的空間解析度提高到幾十奈米。
光電關聯技術的核心難點是同時獲得高質量的電鏡和光鏡圖片，並且實現精確的配準。已有的光電關聯成像方法，要麼無法實現精確配準，要麼折衷某一種成像效果而保全另一種成像效果，從而達到光鏡和電鏡的平衡。例如，前包埋光電聯合成像中，為了保留熒光，先用光鏡對整個細胞成像，然後再進行固定、包埋和切片的電鏡制樣操作
【5,6】
，由於樣品的形變較大，且整體細胞的光鏡影象與超薄切片的電鏡影象難以匹配，導致電鏡成像中不容易找到光鏡影象中的同一細胞，而且無法進行高精度的關聯對準。另外，使用低濃度的餓酸
【4】
或使用其他替代樹脂，如GMA， LR white等，也可以保留部分熒光，但電鏡下超微結構的保持和圖片襯度都要大打折扣。近期，研究人員利用高壓冷凍和冷凍替代
【7,8】
保留了熒光蛋白的熒光和光控特性，實現了超分辨光電關聯成像，但該方法在電鏡中的襯度很低，並且不適合大尺度和連續切片的樣品。
常規電鏡制樣方法，包括使用1% 鋨酸固定來保持細胞的超微結構和電鏡襯度，以及使用Epon包埋來保證樣品的切片質量，能夠獲得高質量的電鏡圖片，並可應用於大尺度生物樣品如腦組織的連續切片和3D重構。但制樣後熒光分子無法保持熒光，主要原因是
鋨酸固定和Epon包埋容易淬滅熒光分子
。因此，急需發展抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，在電鏡制樣的超薄切片中保持熒光，同時獲得高質量的電鏡圖片和高質量的光鏡圖片，實現真正的光電關聯。
2019年10月14日，中國科學院生物物理研究所
徐濤
院士課題組與
徐平勇
課題組合作，在
Nature Methods
上發表了題為
“mEosEMwithstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM”
的研究論文。
他們發展了第一個常規電鏡制樣後保持熒光的光轉化熒光蛋白，首次實現了Epon後固定的同層超薄樣品的超分辨光鏡-電鏡關聯成像，極大地促進了超分辨光鏡和電鏡成像領域的發展，有望帶來生物學中的廣泛應用。
本研究中，團隊成員發展了第一個抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，該熒光蛋白在電鏡制樣後仍然保持熒光並具有光開關的活性，透過最佳化超薄切片中單分子定位演算法和成像方法，首次實現了Epon後固定電鏡樣品的同層超分辨光鏡-電鏡關聯成像。該光電關聯成像方法很好地保留了電鏡影象中線粒體等亞細胞結構，並具有單分子定位超分辨光鏡成像的單分子定位精度。利用該技術合作團隊成功實現了線粒體和核膜的光電關聯成像（圖1）。另外，可以預測，
該熒光蛋白將在神經以及腦科學等需要對大尺度厚樣品進行連續切片和3D重構的光電關聯中得到廣泛應用。
圖1。 線粒體基質（a）和核纖層蛋白（b）的超分辨光電關聯成像結果
徐濤院士領銜的儀器研發團隊近年來致力於顯微成像儀器裝置和技術方法的研究和開發，先後研製出偏振單分子干涉成像、冷凍單分子定位成像以及超分辨光電融合成像系統，開發了多種新的超分辨顯微成像方法。徐平勇課題組主要致力於發展多種用於超分辨成像如PALM/STORM、SOFI、SIM等的探針，並基於探針的光化學特性發展新的成像方法如貝葉斯單分子超分辨成像方法SIMBA等，來提高超分辨成像的時空解析度。該工作是徐濤院士課題組/徐平勇課題組合作，繼PALM成像探針mEos3。2
（Nature Methods，2012）
、活細胞超分辨成像方法Quick-SIMBA
（Nano Letter，2019，
詳見此前BioArt的報道：Nano Letters封面論文 | 徐濤/徐平勇課題組在超分辨成像探針和方法開發中取得新進展
）
後在超分辨成像領域取得的又一重要研究成果。
徐濤
院士、
張名姝
副研究員和
徐平勇
研究員為該文章的共同通訊作者，
付志飛、彭鼎銘、張名姝
為共同第一作者。
原文連結:https://doi.org/10.1038/s41592-019-0613-6延伸閱讀：
專家點評Nature Methods丨徐濤/紀偉團隊研製分子尺度分辨能力干涉定位顯微鏡
製版人：小嫻子
參考文獻
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