CAR-T細胞治療技術原理

CAR-T

CAR-T由英文的Chimeric antigen receptor T cell縮寫而來，漢語直譯為嵌合抗原受體T細胞，可以理解為人為的給正常T細胞加入（嵌合）特定抗原的受體，以使T細胞行使特異的殺傷功能。當這個抗原為癌細胞表面的抗原時，T細胞就可以特異的和癌症細胞結合，從而透過細胞殺傷作用來對癌細胞進行殺傷，即為癌症的CAR-T療法。 在臨床上，CAR-T細胞的治療首先需要收集患者的外周血並收集T細胞，T細胞在體外進行刺激擴增並透過病毒載體轉入特定的CAR基因，被稱為CAR-T，隨後CAR-T再回輸給患者，在患者體內行使其被設定的腫瘤殺傷作用。這一套療法也被稱為CAR-T細胞療法。

CAR-T細胞療法的臨床操作

CAR-T的發展史

1989年，T細胞嵌合受體技術被發現，直到1993年出第一代CAR-T，隨後CAR-T相關技術被不斷髮現和正式，而其臨床價值也被臨床前和臨床試驗所證實，直到2017年，FDA批准了第一款CAR-T療法上市。

CAR-T技術的發展路線

CAR-T的結構

抗原受體結構（single-chainvariable fragment，scFv）

CAR-T最重要的結構是識別腫瘤細胞抗原的部分，該部分結構來源於抗體的scFv結構，組成上包括抗體輕鏈和重鏈的可變區。跟T細胞的TCR不同，scFv在理論上可以（透過體外抗原結合力篩選後）識別所有細胞表面的抗原。正常的T細胞的TCR識別的多為靶細胞內部的肽段，而且識別必須是依賴靶細胞的MHC分子的展示。CAR-T透過scFv識別靶細胞的表面抗原，包括細胞表面的受體、配體等蛋白，增加了靶點識別的廣度，且這種識別不具有MHC的限制。另外，正常的T細胞和靶細胞之間為了形成免疫突觸要保持一定的距離，因為抗原多肽-MHC的大小是固定的，所以這個細胞間距離大約是13-15nm，但細胞外的抗原大小通常是不固定的，因此在CAR-T細胞和靶細胞之間這個細胞間距是隨著抗原的大小和位置變化的，透過scFv可以實現對免疫突觸距離的調控。scFv的設計也有一定的缺陷，人工嵌合的scFv容易形成寡聚體，導致T細胞的耗竭。

TCR和CAR-T的整體結構示意圖

Spacer結構域（或者Hinge結構域）

Spacer結構域是一段小的多肽序列，其作用是把scFv結構域和T細胞隔開。Spacer序列的長短由抗原結合位點到T細胞表面的距離來決定的，距離近的抗原表位需要長的Spacer，距離遠的抗原表位需要短的Spacer。Spacer序列一般是直接擷取自T細胞已有的蛋白序列，長的Spacer可以來源於IgG1或IgG4的CH2CH3結構域（~220個氨基酸），短的Spacer可以來源於CD28、CD8α、CD3或者CD4的片段（~40個氨基酸），而單獨的一個CH3結構域可以作為中等長度的Spacer（~120個氨基酸）。比較長的Spacer容易形成三級結構，因此實際上可能比CD8或者CD28的來源的Spacer要短，且CH2CH3結構域可能和巨噬細胞、單核細胞和NK細胞的Fc受體結合，因而可能導致細胞介導的殺傷作用，因此在進行序列改造的時候需要對CH2CH3的結構進行結構修飾。

不同的spacer結構示意圖

跨膜結構域

跨膜結構域是用於連線CAR的胞內結構和細胞外結構，目前對於此結構的研究相對較少。在設計上一般採用CD4/CD8a/CD28的跨膜區，大約由20個非極性的疏水氨基酸構成，通常會形成α螺旋的二級結構。

共刺激分子序列（細胞內訊號序列）

CAR-T的細胞內訊號轉導序列只有一條鏈構成，當CAR和腫瘤細胞的靶抗原結合後，細胞內序列起到細胞啟用CAR-T細胞活性的作用，而訊號轉導序列的差異也是區分不同代CAR-T的依據。在第一代CAR的設計中，訊號序列取源於CD3ξ（常用序列，含有3個ITAM）和FcRγ（含有2個ITAM）的胞內區域。但是隨後的研究發現一代的CAR-T不能有效的維持T細胞的增殖和活化，在臨床上並未取得令人滿意的效果。

TCR和CAR的對比資料

為了克服第一代CAR-T在臨床應用的缺點，研究人員在第一代CAR-T胞內訊號序列的基礎上串聯了共刺激分子序列，形成了第二代CAR-T的設計邏輯。第二個細胞內序列一般來源於CD28家族（包括CD28和ICOS，Inducible T Cell Costimulator）或者腫瘤壞死因子受體（TNFR，Tumornecrosis factor receptor）家族（包括4-1BB，CD27和OX40）。由於CD28家族和TNFR家族來源的訊號通路序列的作用機制不同，最終設計的CAR-T 產品可能有不同的作用機制。CD28共刺激分子會誘匯出一個生命週期短的、有較高的細胞殺傷活性和大量IL-2分泌的T細胞型別。對應的，設計有4-1BB共刺激分子的CAR-T產品，雖然其細胞因子分泌水平不如CD28CAR-T，但是其在體內的擴增和持續性更強，有著形成記憶T細胞的巨大可能。另外，對於共刺激分子的選擇，可能會影響T細胞的代謝和啟用型別；如何選擇共刺激分子序列暫無研究支援的定論，在目前已上市的產品中，Yescarta用的是CD28家族的共刺激訊號，而Kymriah用的是4-1BB的共刺激訊號。

不同的共刺激分子及其功能

在第一代CAR-T的基礎上，研究者同時使用CD28和4-1BB串聯作為共刺激分子，這樣比第三代CAR-T就多了一個共刺激分子。但是對於第三代CAR-T的臨床效果的報道有好有壞，並未顯示出對第二代CAR-T的優勢；

不同代別的CAR-T設計示意圖

除了上述的第一、第二和第三代CAR-T外，目前延伸出了第四代CAR-T。這種CAR-T在結構上添加了細胞因子基因，能在CAR-T細胞被活化後同時高表達增強T細胞活性的細胞因子，從而提高CAR-T的抗腫瘤活性。

CAR-T殺傷腫瘤細胞的機制

正常的T細胞在行使殺傷作用前需要跟靶細胞結合，並在結合區形成免疫突觸。同樣的，CAR-T細胞也會和靶向形成類似的免疫突觸，但是在結構上和T細胞的突觸略有不同，因此引發的訊號強度及時間也略有不同（見下圖）。

正常T細胞和CAR-T形成的免疫突觸的訊號差異橫軸為時間（min），橫軸上側為CAR-T，下側為正常TCR；紅色線代表細胞活化訊號強度及作用時間，藍色線代表穿孔素和顆粒酶的強度和作用時間。

和T細胞類似，CAR-T細胞和腫瘤細胞透過免疫突觸結合後會透過三種機制來對腫瘤細胞進行殺傷。第一，CAR-T細胞分泌穿孔素和顆粒酶，穿孔素可以在腫瘤細胞表面“打洞”，隨後顆粒酶被輸送到腫瘤細胞內部，直接透過物理作用對腫瘤細胞進行殺傷或者誘導腫瘤細胞發生凋亡；第二，CAR-T細胞表面還會高表達TNF配體，這些配體可以誘導腫瘤細胞凋亡；除以上兩種機制外，CAR-T細胞還會分泌特定的細胞因子，這些細胞因此可以促進CAR-T的活性，改變腫瘤微環境，進一步增強其抗腫瘤活性。

CAR-T細胞透過三種機制殺傷腫瘤細胞示意圖

下一代CAR-T

下一代CAR-T的設計主要聚焦在增加T細胞的活性和持續性，克服腫瘤微環境的免疫抑制、防止腫瘤細胞的免疫逃逸、降低治療的毒性以及提高患者臨床的可及性等方面。

下一代CAR-T的不同設計示意圖

A：雙CAR的設計，在T細胞表面表達識別兩種不同腫瘤抗原的scFv，防止由於腫瘤抗原丟失引起的腫瘤細胞逃逸。B：將兩個識別不同抗原的scF串聯成一個CAR的結構；C：環形串聯scFv的CAR設計；D：聯合的CAR設計，兩種CAR的胞內結構分別為CD3ξ和CD28胞內結構，可以理解成並聯共刺激分子的CAR-T設計；E：syn-Notch受體CAR-T，當scFv識別抗原後，進一步誘導表達識別另一個抗原的CAR，當腫瘤細胞同時表達這兩種抗原的情況，T細胞才會被啟用；F：ON-switch CAR，只有當特定的分子被加入後CAR訊號才會被啟用；G：抑制性CAR，當CAR-T識別正常細胞的抗原後，T細胞的功能被抑制，防止脫靶效應的出現；H：基於抗體的開關設計（通用CAR-T），只有識別特異抗原的抗體結合到CAR上，T細胞才會被啟用，該類CAR-T本身的設計並無特異性，透過改變中介抗體的特異性來實現不同腫瘤抗原之間的通用。

文章首發公號：胖貓的生命醫學札記

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