pcr產物在切膠提純後條帶彌散是為什麼?

漆黑的白雪2021-08-25 10:07:36

圖二中你的marker也出問題了吧？

Neal2021-08-25 16:01:06

當你找不到原因時，所有的都換新的，包括人

是兔嘰不是禿幾2021-08-26 19:37:09

1）pcr產物不純：

可以檢查一下，是不是cycle跑太多了，一般超過30輪就有可能出現non-specific band。

另外extension time也可以查一下，是不是比起你target band size來說太長了，我記得一般是20s/1kb，如果過長也會出現non-specific band。

還有primer sequence可以檢查一下，Tm，secondary structure，GC含量，有沒有類似於ATAT，AATT之類的重複sequence，導致non- specific binding。

2）試劑盒不能全換的話，可以考慮買一支新的KOD buffer。一般試劑盒裡面enzyme最貴，MgCl2和dNTP按我印象出問題情況小一點，單買除了polymerase以外的試劑還是比較便宜的，或者跟其他組借用一下先試試。

3）確實感覺marker看著也有點奇怪，印象裡1kb和100bp的ladder跑出來都不是這樣的pattern（也可能是照片看的不清楚）。如果ladder也奇怪的話，你可以試一下用新的loading dye。

P。S。 關於用了什麼gel 【此處經評論區指出錯誤，已修改】大部分DNA/RNA，包括pcr產物，常用是agarose gel。我之前說肯定是agarose，確實是說的太絕對了。評論區說了也有page跑dna的情況，我查了一下確實是有，因為page的間隔更小，解析度更高，thermo fisher的網站上說的是可以用來分離10-3000bp的DNA。

大部分情況下，page是用來跑蛋白的，sds主要是用來denature蛋白的，方便更直觀的比較分子量，不受蛋白摺疊等因素的影響。之前也忽略了有不denature的情況，在這裡感謝指出問題。

僅供參考，agarose的濃度一般是1-1。5%，sds-page的濃度一般是10-16%【這個只是給出了我覺得常用的濃度範圍，因為分子大小的區別可能會用到其他濃度，但是濃度範圍可以作為一個判斷點】。

周小北2021-08-27 09:03:55

僅為推測，會不會切膠的時候UV太強或者照的時間太長？或者可以用最簡單的方法做對照看是不是你試劑盒的問題：用液氮凍切下來的膠，碾碎，用te buffer泡，然後用這個去跑膠。

或者還有其它神奇的方法：

A Quick， Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose GelDNA extraction from agarose gels （Paper-strip）

Liang Shi2021-08-28 03:13:54

我的感覺是，你的PCR回收產物不是條帶彌散，而是有兩條帶。我放了一張DNA降解條帶彌散的圖，可以看到你的問題不是這樣的。

注意第一道DNA降解導致的條帶彌散

我把你的膠的影象反色，白底黑條紋可以看得更清楚，樣品3-6明顯有兩條條帶。

PCR產物膠

PCR回收產物膠

至於原因，有可能是PCR產物本身就有兩條帶，而你跑回收膠的時候上樣量太大，跑的時間也不夠，所以看上去像一條帶。你可以看到，凡是在回收產物膠裡有明顯兩條條帶的樣品，在PCR產物膠裡的條帶都比較寬。驗證方法也簡單，將PCR產物和回收產物以同樣的上樣量跑同一塊膠，一目瞭然。