體液免疫（三）：B細胞的前世今生（下）

上篇：

體液免疫（一）：抗體

體液免疫（二）：B細胞的前世今生（上）

B細胞離開骨髓後，開始在血液和次級淋巴組織（包括脾臟、淋巴結、扁桃體和Peyer‘s patch）遊走。這時的B細胞還沒有完全發育成熟，表面高表達低親和力的IgM，低表達IgD（成熟的B細胞應當高表達IgD分子，很少表達IgM）。在次級淋巴組織中，他們遇到人生導師CD4+T細胞（又稱輔助T細胞）和樹突狀細胞（dendritic cells， DC）刺激併發育成熟。在經歷了一系列突變、篩選和擴增過程後，成熟的B細胞分化為產生大量分泌型抗體的漿細胞（plasma cells）或記憶B細胞（memory B cell）。

淋巴結是B細胞成熟的主要器官（還有一個比較主要的器官是脾臟，結構和淋巴結類似）。B細胞從血管中流入，透過高內皮小靜脈HEV（High endothelial venules）進入淋巴結；與此同時T細胞由流入淋巴管（afferent lymphatic vessel）進入淋巴結。由外向內，淋巴結依次為B細胞區和T細胞區，兩者交界處即為，這是B細胞接受T細胞教育長大成人的主要場所。淋巴結皮質（cortex）的基底細胞會分泌CCL21（一種趨化因子chemokine）引導B細胞擠過血管內皮間隙進入淋巴結（B細胞對應受體CCR7），DC則同時分泌CCL21和CCL19。在T-B交界處，TFH與具有高抗原親和力的B細胞結合，分泌細胞因子刺激B細胞，後者遷移回到B細胞區並大量增殖，形成生髮中心（germinal center，GC 和長頭髮一點關係都沒有！）

進入以後，B細胞繼續受到濾泡樹突狀細胞（follicular dendritic cells， FDC）分泌的CXCL13（也是一種chemokine，能被B細胞表面受體CXCR5識別）影響來到初級淋巴濾泡（primary lymphoid follicle）中。

B細胞的成熟需要抗原和細胞因子共同刺激。在淋巴結中，樹突狀細胞和巨噬細胞都具有抗原遞呈（antigen presentation）的功能，但在細節上又有所不同：DC主要將處理過的抗原肽遞呈到MHC分子表面，啟用T細胞（尤其是CD4+T細胞）；而巨噬細胞除了傳統的MHC抗原肽遞呈外，還能直接將表面結合的抗原原封不動拖到被膜竇（subcapsular sinus）。這些抗原分子一方面可以直接刺激B細胞，另一方面也能進入濾泡中，與FDC結合。按照能否刺激T細胞，抗原可以分為T dependent（TD）和T independent（TI）。其中不能刺激T細胞的抗原TI又可以分為具有高度重複片段（比如細菌表面莢膜的多糖）的TI-2和能與BCR以及B細胞表面其他受體（比如TLR等固有免疫受體）結合的TI-1。儘管不需要T細胞，TI（尤其是TI-2）還是需要依靠FDC等細胞輔助來刺激B細胞成熟。

SCS巨噬細胞結合抗原，並將抗原拖入生髮中心，交給FDC

大多數抗原屬於TD，它們首先被B細胞表面BCR（主要是IgM、IgD）識別並結合。BCR與抗原結合的同時能啟用下游Ras/MAPK訊號通路，使B細胞被啟用。一部分表面結合抗原被內吞、消化、以肽段形式遞呈到MHC-II分子上，當濾泡輔助T細胞（TFH）識別這些肽段後能向這些B細胞傳送存活訊號，主要透過CD40L（又名CD154）與B細胞表面CD40作用（costimulation）以及分泌細胞因子（例如IL-21，IL-4，IL-6等）兩種方式。CD40與受體結合可以啟用NFκB通路，而IL21與IL21R結合則主要啟用STAT3等訊號通路。TFH刺激B細胞的直接後果是，一部分B細胞編碼IgM的mRNA發生可變剪下，由原來的跨膜蛋白變成分泌蛋白，這類分泌抗體的B細胞被稱為漿細胞（plasma cell）。另一部分啟用的B細胞遷移到濾泡內在大量分裂增殖，形成所謂的生髮中心。

TI抗原可以透過結合補體受體（CR1， CR2）以及CD19、CD81等co-receptor共同啟用B細胞。為了與TI抗原接觸，FDC起到了抗原呈遞作用。從起源上，FDC與Myeloid /plasmacytoid DC均不同：嚴格地說，它並不是造血幹細胞分化而成的，而是來源於濾泡基底細胞。功能上，FDC呈遞的是未經消化的完整抗原，這樣的抗原更接近於真實狀態下的病原體，因而能被B細胞識別。除了呈遞抗原外，FDC還會分泌一種叫BAFF的細胞因子（屬於TNF蛋白家族），刺激B細胞存活併成熟。經過初級淋巴濾泡後的B細胞即為成熟B細胞（mature B cell），它們表面將高表達IgD、低表達IgM。如果沒有遇到特異的抗原，則會離開初級淋巴濾泡回到血液中繼續迴圈，稱之為幼稚 （Naive） B細胞。（注意區分術語：幼稚B細胞是沒有遇到抗原的B細胞，而不成熟B細胞是指未經過初級淋巴濾泡訓練的B細胞！）

接觸抗原

幼稚B細胞接觸了來自FDC或SCS MΦ抗原後，BCR與抗原表位（epitope）結合，使得受體構型變化，刺激下游訊號通路啟用。CD79是該訊號通路的始發者，它由兩條不同的跨膜鏈α、β形成二聚體，胞內為ITAM （Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）結構域。ITAM結構域上的酪氨酸（Tyr）透過磷酸化和去磷酸化實現訊號調控，這其中比較重要的磷酸激酶包括LYN、SYK、PLC、BTK等等。關於B細胞和T細胞訊號通路，將在後面的章節中單獨講述。數小時後，B細胞開始表達EBI2受體（一種固醇類化合物受體），並遷移到濾泡外部區域，準備與T細胞接觸。

Nature Reviews Cancer volume 18， pages 148–167 （2018）

生髮中心反應（germinal center reaction）

B細胞受到抗原刺激前後表達的抗體會完全不同。IgM、IgD屬於低親和力（low affinity）抗體，而被抗原啟用的B細胞主要分泌IgG等高親和力抗體。在淋巴結等次級免疫器官中，B細胞在TFH等誘導下發生體細胞超突變（somatic hypermutation， SHM）和亞型轉化（class switch），逐步產生高親和力的抗體，這一過程稱為affinity maturation。幼稚淋巴細胞（naive lymphocyte）中，對於某一抗原特異的細胞比例很低，往往少於萬分之一。也就是說，對某一抗原特異的CD4+T細胞和B細胞在血液中相遇的機率要低於億分之一（

）。而在淋巴結中，由於受到抗原刺激和啟用以及GC特殊環境加成，B細胞遇到正確伯樂的機率會大大增加。

GC confocal imaging showing different regions。 紅色：anti-IgD； 藍色：anti-CD3（T細胞）；綠色：antigen-specific B細胞。J ALLERGY CLIN IMMUNOL VOLUME 126， NUMBER 5， 2010， Pages 898-907

被TFH啟用的B細胞部分遷移到髓質索（medullary cord），5天左右以後擴增形成原發灶（primary focus）。這些細胞一般都是具有較高親和力的IgM分泌原漿細胞（plasmablast），它們是病原體感染第一階段的體液免疫細胞。通常這些細胞壽命較短，不能形成成熟漿細胞（plasma cells）。

另外大多數被TFH啟用但親和力不夠高的B細胞會進入濾泡，在這裡大量增殖形成生髮中心。含有GC的濾泡被稱為次級濾泡（secondary lymphoid follicle）。GC內絕大多數細胞為B細胞，也有約10%的Tfh細胞。B細胞區內可以進一步分成暗區和亮區（dark & light zone）以及外套區（mantle zone）。靜息B細胞（也就是不分裂的B細胞）會向外套區遷移，凋亡並被巨噬細胞清理；分裂的B細胞集中於GC內部，最初快速分裂的B細胞（每6~8h分裂一次）稱為中心母細胞（centroblast），它們表面高表達CXCR4和CXCR5，低表達免疫球蛋白，主要分佈在暗區（這裡細胞密度較大，故得名）；而後分裂速度減慢，下調CXCR4表達量，但逐漸開始高表達免疫球蛋白，並向亮區（細胞密度較低）遷移，稱為中心細胞（centrocyte）。

GC是一個高出生率、高死亡率的場所：分裂產生的B細胞必須與TFH結合，高親和力的B細胞被T細胞啟用，倖存下來；低親和力B細胞遭到淘汰，發生凋亡。只有與抗原親和力較高的B細胞才能在亮區與更多FDC上的抗原相互作用，攝取抗原並將其呈遞到MHC-II表面，進而被T細胞識別，因此這種選擇並不是直接根據抗原親和力，而是間接透過抗原表面遞呈實現的。（思考：如果抗原不是蛋白，而是多糖或者小分子，會對GC反應產生怎樣的影響？）成功倖存的B細胞回到暗區，繼續分裂和突變，接受下一輪篩選，直到產生極高親和力的抗體。這一過程大約需要2~3周時間。此時完成分化的B細胞離開GC，成為記憶B細胞（memory B cell）和長壽漿細胞（long-lived plasma cell）。

體細胞超突變（SHM）

除了上一章中提到的VDJ重組外，B細胞還可以透過體細胞超突變SHM產生更多多樣性，這也是GC反應中提高抗體親和力的重要過程。介導這一反應發生的酶是一種被稱為AID的胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase）。AID擁有一個以Zn離子為核的催化中心，可以將胞嘧啶的氨基水解為羰基（也就是變成尿嘧啶U）。我們知道，U是不應該出現在DNA中的，因此會被細胞核中的DNA修復機制識別並修復。這種修復可能引入鹼基突變，從而改變抗體可變區的氨基酸序列。研究表明，AID對於超突變和亞型轉化都至關重要：AID突變型小鼠既無法產生高親和力的抗體，也不能發生亞型轉化，其體內只有大量低親和力的IgM。

AID酶的近親，APOBEC1也是一種胞嘧啶脫氨酶，但它識別的底物是mRNA。AID只能識別單鏈DNA，不識別雙鏈DNA，因此只有正在轉錄的基因區域可能被AID破壞。B細胞的免疫球蛋白基因作為高表達基因，自然有更大的機率被AID編輯。

尿嘧啶的引入主要會誘導兩種DNA修復通路：錯配修復（mismatch repair）和鹼基切除修復（base-excision repair）。錯配修復首先由MSH2/6蛋白識別錯配鹼基，在新合成的鏈（尚未甲基化）上切去錯配鹼基附近的一小段（通常數百鹼基對），並引入DNA聚合酶補齊缺失的鹼基，最後由DNA連線酶連上缺口。錯配修復使用的DNA聚合酶（Polη）具有低保真特點，往往會引入較多突變，尤其是在A：T鹼基對上。有趣的是，只有B細胞在修復錯配時會使用低保真的Polη，而其他正常細胞中一般會用較高保真度聚合酶。

鹼基切除修復需要一種叫做UNG（uracil-DNA glycosylase）的酶參與。UNG會將尿嘧啶鹼基從核糖糖環上水解下來，形成一個空位。如果細胞沒有及時修復，則下一輪複製時該位點會隨機插入一個鹼基（REV1參與）。或者，一種叫APE1的酶發現了該空位，將該核苷酸剪去，形成單鏈斷裂位點，再由其他酶進行修復。

亞型轉化主要與轉化區鹼基切除修復通路有關。B細胞BCR基因座上編碼多個C區基因，依次為μ、δ、γ（γ鏈有4種以上亞型）、ε、α鏈。在每個C區前（δ鏈除外）都有一段保守的S片段（switch region），S是由一些重複的DNA片段組成，且在非編碼鏈上有較多G。當轉錄酶移動到該區域時常常暫停於此，並招募AID。S區的兩條鏈上都有較多胞嘧啶，在AID和UNG、APE1作用下可發生雙鏈斷裂（double strand break）。此時細胞啟動雙鏈斷裂修復機制（非同源重組末端連線，NHEJ），將中間的基因剪去，直接連線到後面的基因上。

AID介導的亞型轉化機理，圖片來源J Immunol。 Dec 1， 2014， 193 （11）： 5370-5378

亞型轉化的過程並不是隨機的，而是透過TFH分泌不同細胞因子（cytokine）精密調控的過程。細胞因子會首先促進某些亞型C區域的轉錄（但是由於缺少起始密碼子，這些基因並不能翻譯成蛋白），進而誘導亞型轉化。例如IL-4可以促使B細胞表達IgG1和IgE，IL-21促進IgG3、IgG1和IgA表達等。

分化：記憶B細胞與漿細胞

完成親和力飽和與亞型轉化的B細胞離開GC，進入分化階段。此時B細胞下調Bcl-6和Pax5兩種轉錄因子表達量，開始表達IRF4和BLIMP-1，形成漿細胞。漿細胞與GCB相比，分裂速度減慢，大量分泌高親和力的IgG等免疫球蛋白，表面低表達CXCR5，高表達CXCR4。大部分漿細胞的壽命較短（主要集中在淋巴結髓索和脾臟紅髓質red pulp），而少數遷移到骨髓中的漿細胞在骨髓環境刺激下具有較長壽命。

另外一部分B細胞分化成記憶B細胞，這類細胞壽命極長，甚至可以伴隨終生。記憶B細胞表面低表達亞型轉化的免疫球蛋白，也特異表達CD27（記憶B細胞標誌物），一旦遇到抗原，便能迅速發生生髮中心反應，大量增殖並分泌免疫球蛋白。按照免疫球蛋白亞型不同，記憶B細胞主要可以分為IgG+和IgM+兩種。IgG+記憶B細胞再次遭遇抗原後大量增殖，分化為漿細胞；而IgM+記憶B細胞再次遭遇抗原後進入生髮中心，繼續發生SHM。

小結

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B細胞遭遇抗原後，在次級淋巴組織中成熟，產生更高親和力、不同亞型的免疫球蛋白，並分化成漿細胞和記憶B細胞。生髮中心反應（Germinal Center Response）是B細胞成熟的重要過程之一。B細胞的成熟不僅要靠自身奮鬥，還需要伯樂（TFH， FDC）的提拔和歷史程序的安排（隨機突變都是命）。

B細胞發育全過程彙總

思考題

基底細胞來源的濾泡樹突狀細胞（FDC）和骨髓來源的樹突狀細胞都屬於抗原呈遞細胞，但它們呈遞抗原的方式卻有很大不同。簡述該區別，並說明這樣的意義。

B細胞產生高親和力抗體需要輔助T細胞的幫助。患有DiGeorge綜合徵的嬰兒胸腺不發育，體內無法產生T細胞但B細胞在骨髓內的發育過程不受影響。患者易受到各種機會感染，且通常死於兩歲前。研究表明，患者體內無法產生IgG，但有部分B細胞可以分泌低親和力的IgM。為什麼這些B細胞可以分泌IgM？這些抗體可能的抗原是什麼？

除了pMHC-TCR外，TFH與GCB細胞還透過哪些受體相互作用？這些受體相互作用對B細胞和TFH的意義是什麼？

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參考答案：

FDC直接將天然狀態的抗原（通常是被補體或抗體捕獲的抗原）吸附於表面，而傳統DC需要吞噬抗原，並將其消化為肽段呈遞在MHC分子表面。由於B細胞免疫球蛋白識別的是天然狀態的抗原，因此FDC這種特殊的抗原呈遞方式可以有效保證篩選出抗原特異的B細胞。

這些抗原為T-independent抗原，主要是具有高度重複片段的抗原（如多糖類）、啟用固有免疫受體的病原體特徵分子（如LPS、LTA）或者能被補體識別標記的細菌表面膜蛋白等。它們能透過交聯BCR、啟用TLR等固有免疫受體或者補體受體的方式啟用B細胞產生IgM。

TFH-GCB 互作受體包括CD40L-CD40（共刺激受體）； SLAM-SLAM（T細胞啟用因子）； LFA1-ICAM1（胞間粘連蛋白，增加TFH與GCB的相互作用、篩選低親和力B細胞）等；以及TFH分泌的IL-4、IL-21等細胞因子（促進B細胞生長和亞型轉化）。