PCR相關技術與分子雜交技術概要

。PCR技術

1。原理：在體外用耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，以親本的DNA為模板產生新的相同的子代DNA

2.PCR步驟

（1）反應體系

①模板：可以是DNA也可以是RNA

②引物：引物決定PCR擴增產物的特異性與長度

③耐熱的TaqDNA聚合酶

④緩衝液：提供PCR反應合適的酸鹼度與某些離子

⑤Mg2+：Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶的活性影響很大，Mg2+濃度過低，Taq酶活性顯著降低；Mg2+濃度過高，又使酶催化非特異性擴增

（2）步驟

①變性：當反應體系被加熱至94℃左右並保持一定時間後，雙鏈模板DNA

氫鍵

斷裂而解離為單鏈DNA，以便與特異引物結合

②復性：變性完成後，將反應體系的溫度迅速降至低於Tm值5℃左右，特異性的引物就會和單鏈模板DNA的互補序列雜交

③延伸：將反應體系的溫度升到72℃，單鏈，四種dNTPs為反應原料，按照鹼基互補配對原則使DNA不斷延伸

④迴圈次數：一般為25~30個週期

（3）常見問題

①假陽性：由於PCR反應的靈敏度極高，所以只要汙染了微量的靶基因，就會造成大量擴增；若樣品中含有靶基因的同源序列，也會出現假陽性；為了避免出現假陽性，試劑要分裝，槍頭及離心管等均應一次使用，簡化操作

②假陰性：即PCR反應本應出現擴增條帶而沒有出現

原因：

·Taq酶失活，或活性受到了抑制

·引物的設計或合成錯誤

·提取的模板質量和數量達不到要求

·變性的溫度和時間不合理

3.反轉錄PCR（逆轉錄PCR）

（1）定義：利用逆轉錄酶將組織和細胞中的RNA反轉錄成為cDNA，並以此為模板透過PCR進行DNA擴增來間接檢測RNA的鏈式聚合酶反應

（2）步驟

①將單鏈RNA分子逆轉錄為互補的單鏈DNA（cDNA）

②以合成的cDNA為模板，根據不同目的選擇合適條件進行PCR擴增

4.Real-TimePCR（實時定量PCR）

即在PCR體系中加入熒光訊號強度與DNA數目相關的熒光物質，並透過對PCR擴增反應中每一個迴圈產物熒光訊號的實時變化檢測來實現對其實模板定量及定性的分析工作

5.RACE-PCR

定義：指以mRNA為模板，反轉錄合成cDNA的第一條鏈，然後用PCR技術擴增出從某個特定位點到3’-5’的未知

核苷酸

序列

適用：在鑑定和分離新的cDNA的時候碰到整個基因只有一部分序列已知，而絕大多數的物種沒有完成全基因組測序

6.反向PCR

（1）定義：反向PCR是從一般PCR中改進出來得一種用於擴增一段已知序列兩側DNA的方法（反向PCR可以擴增與已知DNA區段相連線的未知染色體DNA序列——染色體步移技術）

（2）方法：

①根據已知序列設計一對引物（這對引物的3’端是相互反向的）

②尋找合適的限制性內切酶

③酶切得到一個含有已知序列且兩端酶切位點相同的DNA片段

④用連線酶將這段DNA片段環化，即可以利用開始合成的那對引物進行PCR擴增，由於引物3’端是相互反向的，故可以擴增出臨近已知片段的序列

7.PCR定點誘變

（1）定義：定點突變是透過聚合酶鏈式反應PCR等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是表徵有利方向的變化），包括鹼基的新增、刪除、點突變等

（2）應用：研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特徵、改造啟動子或者DNA作用元件、提高蛋白的

抗原性

或者穩定性、活性，研究蛋白的晶體結構，以及藥物研發、

基因治療

等方面

（3）方法：

①在基因5’和3’端產生突變

②在基因內部產生突變

分子雜交技術

原理：將標記的核酸探針（probe）以鹼基互補配對原則與組織細胞中待測

核酸

進行特異性雜交組合，形成探針標記與待測核酸的雜合體，然後利用各種標記物的顯色技術，在光學顯微鏡、熒光顯微鏡或

電子顯微鏡

下探索待測目標核酸（mRNA或DNA）的存在及位置；因此，分子雜交技術的實質是標記的核酸探針與待測核酸形成雜合體

1.Southern雜交

（1）目的

透過Southern雜交可鑑定目的基因在

基因組

中的複製數

（2）步驟

·基因組DNA提取和限制酶消化

·瓊脂糖凝膠電泳分離基因組DNA樣品及預處理

·轉膜：將凝膠中的單鏈DNA片段轉移到固相支援物上的過程（因為轉移後DNA片段在膜上的相對位置與凝膠中的相對位置一樣，也稱為印跡）

·探針標記：用於Southern雜交的探針一般是純化的DNA片段或寡核苷酸片段

·預雜交、雜交和洗膜

預雜交：固相支援物能與DNA結合，同樣也能與探針結合，因此在

雜交

之前，必須把固相支援物上所有能與DNA結合的位點全部封閉

雜交：轉印膜在預雜交液中溫育4`6h後，即可加入變性的標記DNA探針與膜上待測DNA片段進行雜交反應

洗膜：雜交過夜後，在較高溫度下用鹽溶液洗膜

·放射自顯影檢測

2.Northern雜交

（1）原理

（2）操作過程

·RNA的提取

·RNA變性凝膠電泳：由於RNA容易降解，RNA電泳所需的緩衝液、試劑和儀器均需用DEPC水處理。RNA在凝膠電泳前，需進行變性處理，處於RNA中的二級結構，保證RNA完全按

分子

大小分離

·RNA的轉膜：毛細管虹吸印跡法、電轉移法和真空轉移法

3.Western雜交

（1）原理

（2）操作過程

·蛋白樣品的製備

·SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳

·蛋白轉膜

·免疫檢測

4.菌落原位雜交

（1）定義：由Southern雜交的技術上發展的一種雜交技術，它能從成千上萬個重組子中迅速檢測出期望的與探針序列同源的重組子

（2）原理：將細菌菌落或噬菌斑從培養平板透過影印轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後將濾膜上的菌落用0。5mol/lNaOH裂解菌落以釋放出DNA，將DNA烘乾固定於膜上與放射性同位素標記的特異性DNA或RNA探針雜交，放射自顯影檢測

菌落

或噬菌斑雜交訊號，並於平板上的菌落或噬菌斑對位，從中挑選出含有目的條帶的菌落或噬菌斑（同Southern）

5.熒光原位雜交（FISH技術）

（1）定義：熒光原位雜交技術是將分子雜交和組織化學相結合的一種重要的非放射性原位雜交技術，可用於已知的基因或序列的

染色體

定位，還可用於克隆基因或遺傳標記及

染色體畸變

的研究

（2）原理

利用與待檢測的染色體或DNA顯微切片上的靶DNA相互補的核酸探針進行染色體水平上的原位雜交。核酸探針與染色體或DNA顯微切片上的靶DNA經過變性、退火、

復性

等步驟後，靶DNA與核酸探針特異性結合形成雜合體

PS：FISH探針分類

①直接標記探針：熒光分子直接標記在探針的某個核酸上

②間接標記探針：先用生物素或

地高辛

等中間分子標記核酸探針，然後利用中間分子與熒光素標記的特異親和素進行免疫組織化學反應，經熒光檢測系統在熒光顯微鏡下進行定性、定量、定位分析

（3）方法

·染色體標本製作：fish所要檢測的靶DNA或RNA固定在載玻片上的

細胞核

內

·探針熒游標記

·雜交前處理與雜交：前處理包括染色體載玻片的處理、染色體變性和探針變性

·染色體顯帶

·熒光顯微鏡檢測