實驗筆記丨流式細胞法檢測病毒滴度
病毒載體類基因治療產品的感染滴度是該類製品一項重要的質控指標，對於質量評價和臨床劑量指導具有重要意義。
與傳統的免疫熒光法相比，流式細胞法具有操作簡便、結果客觀和精密度高等優點，
從以下幾點進行分析：
①
免疫熒光法將樣品稀釋 2 × 10^6倍，採用單點上樣，無法避免高倍稀釋帶來的累計誤差，而流式測定採用多個稀釋度，採用曲線擬合，彌補了這種不足。
②
免疫熒光法肉眼觀測記數，客觀性差，不同操作者之間變異較大，而流式測定藉助儀器分析，結果更客觀。且免疫熒光法需要在熒光顯微鏡下對六孔板全視野進行肉眼觀測計數，操作繁瑣，而流式測定藉助儀器，操作簡便。
③
如果被感染的細胞有一定比例由於狀態不好，無法支援病毒大量複製，或由於染色原因造成一定比例假陰性，採用免疫熒光法無法避免這種誤差，會造成結果偏離。而流式測定的數學模型中引入引數 A，可將此誤差校正，而結果判定由 B 決定，避免了對結果的影響。
④
病毒感染細胞後到染色之前需培養3 d，在此過程中一小部分細胞（ 包括感染細胞和非感染細胞） 會分裂，免疫熒光法鏡下觀察常見 2 個熒光細胞連在一起的現象，很難區別是 1 個陽性細胞分裂為 2 個還是 2 個單獨的陽性細胞（ 實際操作中若 2 個細胞間隔大於 1 個細胞直徑則判定為 2個，否則判定為 1 個） ，給結果判定帶來誤差，而流式測定是記數陽性比（ 細胞分裂前後，陽性比不會改變） ，避免了細胞分裂帶來的誤差。
數學模型的建立
本數學模型的建立是基於泊松分佈，泊松分佈主要用於描述單位時間（ 空間） 中稀有事件的發生數，所謂隨機變數 x 服從泊松分佈，是指 x 取值範圍為 0，1，…； 其相應取值機率為：
P
= μx× e－μ/ x！
公式( 1)
泊松分佈適合於模擬病毒感染單細胞層面，由於病毒的體積相對於細胞極小，一定量的病毒感染單細胞層面時，可看作一定區域內某種微生物的計數分佈。而且該仙台病毒為傳播缺陷型，子一代病毒不會感染其他細胞，在某一感染複數（ multiplicity of infection，MOI，病毒與細胞總的數量比，相當於1 個細胞的區域範圍內平均有 MOI 個病毒） 情況下，1 個細胞被 k 個病毒感染的機率為：
P（ X =
k
） = MOIk× e－MOI/
k
！
公式( 2)
每個細胞被感染的機率 P（ cell infected） 即細胞至少被 1 個病毒感染的機率為：
P（ cell infected） = P （ k ≥1 ） = 1 － P （ k = 0 ） =1 － e－MOI
公式( 3)
在此 MOI 下，細胞被感染的陽性百分數為：
Positive / % = 100 × （ 1 － e－MOI）
公式( 4)
假設樣品中實際的病毒感染滴度為 m，實驗前由於 m 未知，假定其滴度為 n，此處引入一個引數B，且 m = B × n。根據假定值 n 將樣品做成不同稀釋度，結合細胞計數得到不同的 MOIn，由於 m = B × n，則 MOI = B × MOIn（ MOI 為對應於 m 的實際值，MOIn為根據假定值 n 得到的表觀值） ，將其代入上式，同時被感染的細胞中可能有一定比例由於狀態不好，不能表達大量病毒蛋白，染色時有一定比例為假陰性，需引入一個引數 A 來反映染色效率，即：
Positive / % = 100 × A × （ 1 － e－B × MOIn）
公式( 5)
此即為所建立的數學模型，透過曲線擬合得到B 值，即可透過 m = B × n 計算樣品的感染滴度。
實驗方法的建立
1、取對數生長期的細胞，用含 10% FBS 的 MEM 完全培養基製備細胞懸液，按 2 m L 含有 2。 5 × 105個細胞的濃度接種於六孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養 72 h，感染病毒前棄去培養上清並以 PBS 洗 1 遍後備用；
2、病毒上樣前首先選擇 2 個孔，將細胞消化後記數，取平均值得到每孔細胞總數。結合細胞總數，假定值n，病毒上樣體積為 100 μL，將樣品用 1% BSA-PBS做不同稀釋度，得到不同的 MOIn；
3、病毒上樣，每個MOIn對應 1 個細胞孔，上樣體積為 100 μL，同時設一陰性孔（ 1% BSA-PBS，100 μL） ，37 ℃、5% CO2條件下培養 1 h，其間每隔 15 min 搖勻 1 次； 孵育結束後，吸棄培 養 液 並 用 PBS 洗 1 次，加 入 2 m L 的MEM，37 ℃ 、5% 的 CO2培養箱培養 72 h；
4、培養結束後，以 0。25% Trypsin 消化細胞後轉入流式檢測管，離心後先以 750 μL PBS 重懸細胞，置振盪器上緩慢加入 250 μL 16% 多聚甲醛，4 ℃孵育 30 min，離心後棄上清； 以 1 m L 0． 1% Triton X-100-PBS 重懸細胞，37 ℃ 孵育 15 min，離心後棄上清；
5、以 1 m L 5% FBS-PBS 重懸細胞，室溫孵育 30 min，離心後棄上清； 每管加入 0。5 m L 兔抗仙台病毒多抗，4 ℃孵育 60 min，離心後以 1% BSA-PBS 洗 1 次；
6、每管加入 0。 5 m LFITC 標記的羊抗兔 IgG 二抗，4 ℃ 孵育 60 min，離心後以 1% BSA-PBS 洗 1 次；
7、每管加入 0。5 m L PBS，混勻後流式上機檢測。以陰性管設定陰性區和陽性區的分界線，然後記錄各管的陽性細胞百分數（ 即各MOIn對應的陽性細胞百分數） ；
8、以 MOIn為橫座標，陽性百分數為縱座標，根據所建立的數學模型，使用Curve Expert 1。3 做曲線擬合，得到 B 值，則實際感染滴度為 m = B × n。
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