【精品解讀】18分，來看看miRNA與靶基因研究的秀兒！
中國學者儼然已經對“套路式研究”充滿排斥。
從熱點追逐，到形成套路，再跟風灌水，最後疲倦嘲諷，彷彿是中國學者陷入的研究怪圈。
於是，三五年miRNA、三五年lnc、circRNA，到現在的m6A、
外泌體
、焦亡、鐵死亡。。。
我們需要它，利用它，又嫌棄它。
要知道，科研本沒什麼熱點冷點，最終都是大道相通，科研擁有著最底層的通用邏輯，即高層次的
思維模型
。
今天，小編就來帶大家看一篇 old fashion的miRNA與靶基因的經典文獻，該文發表於Journal of Hepatology雜誌，影響因子18。94。
主要講的是，miR-221-3p結合Gnai基因3’UTR區調節HSCs細胞活化影響肝纖維化。
肝纖維化專題課程：
乍一看，很多人都覺得：套路，老套路！
荔枝微課
乍一看，很多人都覺得：套路，老套路！
恩，小編一開始也是這麼覺得的，但是，本文最大的研究亮點在它的fig1，即如何發現並獲得了影響肝纖維化的miR-221-3p。
按一般的研究套路，大部分的老師會選擇臨床樣本或動物模型樣本進行大規模的測序，篩選差異miRNAs。但本文秀就秀在沒有按套路出牌，而是將miRNA文庫（302個不同的miRNA的mimics）直接與
小鼠肝細胞
及肝星型細胞進行共孵育，發現有15個miRNAs直接與肝纖維啟用有關。然後再用ELISA檢測了上清中TIMP1（可調節肝纖維化）的表達水平，最終發現並確定了miR-221-3p。
文章總結
作者透過動物造模、細胞轉染、共培養、過表達、干擾載體構建等實驗方法，
使用qPCR，
原位雜交
，WB，HE，天猩紅染色，
免疫熒光
，ELISA等檢測技術得到了如下結論。
悄悄告訴大家，這些實驗我們都可以做，可隨時Call我哦
結論：在慢性肝損傷期間，
阻斷肝細胞中的miRNA-221-3p功能有助於肝臟的恢復和更快地解決細胞外基質的沉積問題。
此外，作者證明，
miRNA-221-3p對GNAI2具有轉錄後調控作用，導致C–C motif趨化因子配體2的分泌減少，從而減輕了肝纖維化。miRNA-221-3p的抑制可作為治療肝纖維化的治療方法之一。
Fig 1 透過miRNA文庫篩選得到一個潛在的纖維化調節子：miR-221-3p
作者首先用miRNA文庫與小鼠肝細胞進行孵育，然後與Col-GFP HSCs細胞（可簡單理解為肝纖維化報告細胞）共培養，得到了15個肝纖維化相關的miRNA，之後ELISA檢測TIMP1基因（可以調節纖維化）的表達水平，進而
獲得了潛在的纖維化調節子：miR-221-3p。
（A-E）
註釋：Col1a1， Acta2， Tgfbr1均為纖維化的標誌物。
Fig 2 在肝纖維化過程中，原代肝細胞中的miR-221-3p表達上調
原位雜交和qPCR結果顯示，肝纖維化小鼠的肝臟miR-221-3表達量顯著高於對照組（A，B）。之後分離純化肝纖維化小鼠的肝細胞、肝星狀細胞、
Kupffer 細胞
，發現在
肝細胞、肝星狀細胞中，miR-221-3p的表達量顯著高於對照組
（正常小鼠）（C）。作者之後構建了TuD-miR-221-3p（AAV -Tud） 以後續進行miR-221-3p的敲降。（D，E證明了構建的TuD-miR-221-3p 是有效的）
註釋：PUMA （BBC3編碼）已知的miR-221-3p靶向蛋白。
Fig 3 在肝細胞中，miR-221-3p的抑制可減輕肝纖維化
作者進行纖維化小鼠模型構建，並在第6周和第8周注射AAV -Tud，第9周取小鼠組織進行相關實驗，qPCR結果顯示與Control組相比，AAV -Tud注射組的miR-221-3p 表達量顯著降低，WB檢測其
靶向蛋白PUMA
，與Control組相比，PUMA表達量明顯上升。由此表明了miR-221-3p功能被抑制（A-C）。之後對組織進行病理染色，與Control組相比，AAV -Tud注射組肝纖維化區域少，且肝損傷以及細胞浸潤減少（D，E） ，且血清中的AST、 ALT、bilirubin含量降低（E）。由此表明，
miR-221-3p功能抑制可減少肝損傷。
因為纖維化的發展是由HSCs調節的，作者對HSC啟用相關的標記蛋白（Col1a1， Acta2， Tgfbr1）進行檢測，發現與Control組相比，miR-221-3p的敲降組的肝細胞和肝星狀細胞中Col1a1、 Acta2、Tgfbr1表達均下調（F，I）。IF結果顯示與Control組相比，miR-221-3p的敲降中a-SMA和結蛋白陽性細胞明顯降低（H）。
ɑ-SMA：ɑ
平滑肌肌動蛋白
， 靜止的HSCs透過分化為表達平滑肌肌動蛋白（ɑ-SMA）的成肌纖維細胞而被啟用。
Fig 4 在肝纖維化程序中，miR-221-3p參與Gnai2的轉錄後調控
作者透過生物資訊學分析以及相關軟體預測，獲得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2（有文章表明其在
慢性肝病
中扮演重要角色）（A）。WB和qPCR結果顯示，與健康組相比GNAI2的表達水平較低（B），與Control相比，AAV Tud組GNAI2表達水平提高（C，D），這可能與miR-221-3p的上調有關。之後用miR-221-3p mimics處理正常肝細胞，結果顯示，與
陰性對照組
相比，miR-221-3p mimics處理組的GNAI2表達水平顯著降低（E）。雙熒光素酶實驗結果進一步證明了miR-221-3p mimics直接靶向Gnai2的3’UTR。綜上，作者證明
miR-221-3p直接參與Gnai2的轉錄後調控。
Fig 5 肝細胞中，miR-221-3p的抑制透過GNAI2抑制了HSCs的啟用
為了探討肝細胞中Gnai2的調節是否啟用HSCs，作者用Gnai2基因過表達載體處理肝細胞（Gnai2 ovx組），處理一段時間後與
HSCs細胞
共培養，之後做qPCR和免疫熒光染色，結果顯示，與對照組相比，p75NTR、ɑ-SMA、Desmin表達量顯著下調。（A，B）
之後作者用miR-221-3p inhibitor以及siGnai2處理肝細胞一段時間後與HSCs細胞共培養，免疫熒光染色結果顯示，siGnai2處理抵消了miR-221-3p inhibitor導致的HSCs的啟用（C）
。這些結果表明，
在肝細胞中，GNAI2有助於減少miR-221-3p抑制時HSC的啟用。
備註：p75神經營養素受體（p75NTR）在靜止的HSCs中以低水平表達，但在HSCs啟用後迅速增加。
Fig 6 在肝細胞中，GNAI2的上調抑制CCL2表達，進而抑制HSC啟用並改善肝纖維化
之後作者想要搞清楚透過GNAI2啟用HSCs的機制，作者認為CCL2可能是miR-221-3p/
GNAI2訊號的關鍵部分。作者發現在肝細胞中，與Control組相比，AAVTuD組的CCL2 mRNA顯著下調，但在非實質細胞中沒有這個現象（A，B）。在肝細胞中，Gnai2過表達可以減少CCL2的分泌（C）。
ELISA結果顯示miR-221-3p抑制引起CCL2的減少（D）。用siGnai2處理，CCL2的分泌量顯著增加
（E，F）。
為了進一步驗證CCL2對HSCs的直接影響，作者用CCL2處理HSCs，之後用QPCR和免疫熒光染色結果顯示， Col1a1、Acta2、Tgfbr1 mRNA水平和p75NTR、a-SMA、desmin蛋白質水平顯著增高（G，H）。miR-221-3p inhibitor處理後用同樣的方法測相同的指標，結果與CCL2處理組相反（I，J）。
以上結果表明，
在肝細胞中，miR-221-3p inhibitor導致GNAI2的上調，而GNAI2的上調進而抑制CCL2表達，從而抑制HSC啟用並改善肝纖維化。
備註：趨化因子CCL2，一個關鍵的調節因子炎症和肝纖維化。已據報道，在
小鼠Gnai
2基因敲除後升高。
Fig 7 DDC模型中，miR-221-3p抑制同樣可減少其肝纖維化
作者為了確定miR-221-3p抑制效果是否僅限於CCl4模型，作者構建膽汁淤積性纖維化（DDC）模型，之後做病理染色以及肝纖維化相關指標的mRNA分析，結果與CCl4模型一致（B-F）。由此可知，
miR-221-3p抑制同樣可減少DDC模型的肝纖維化。
Fig 8 改變miR-221-3p在原代人肝細胞中的表達，抑制原代人肌成纖維細胞纖維化。
為了檢測本研究是否適用於人類肝細胞，作者使用
miR-221-3p inhibitor
處理過的培養基上清處理原發性人類肌成纖維細胞，對Col1a1、Acta2、Tgfbr1進行定量QPCR分析，對p75NTR、a-SMA、desmin、LOX進行免疫熒光染色。結果顯示，與Scr組相比，miR-221-3p inhibitor處理組的纖維化相關標記表達水平顯著降低（B，C）。這些結果表明，
處理miR-221-3p處理組的培養基上清抑制原代人肌成纖維細胞的啟用。
最後，作者從纖維化肝臟中分離原代人肝細胞中，檢測miR-221-3p的表達是否有改變。qPCR結果顯示與對照組相比，miR-221-3p的表達顯著提高，GNAI2表達降低，CCL2表達升高（D，E）。
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